内容提要
CO不仅可以选择性地杀伤肿瘤细胞，而且由于缺乏主动的肿瘤靶向能力，抗肿瘤效果有限。将线粒体靶向的线粒体内微环境响应前药(FeCO-TPP)封装在介孔二氧化硅纳米颗粒内，再通过静电分步组装，将其包覆在透明质酸上，构建一种新型智能纳米药物，并以分步分解的方式实现肿瘤组织细胞/线粒体靶向的CO多阶段控制释放。CO的多阶段靶向控释释放包括(i)被动靶向肿瘤组织的纳米药物释放，(ii)主动靶向肿瘤细胞的纳米药物释放，(iii)酸响应性前药释放，(iv)线粒体靶向性前药释放以及(v)ROS响应性CO释放。该纳米药物有效地增强了CO在体内外治疗癌症的有效性和安全性。本文提出的多阶段组装/解组装策略为CO的靶向治疗打开了一个新的窗口。
结果与讨论
FeCO-TPP前药和FeCO-TPP@MSN@HA的关键是既能以靶向的方式积累到线粒体中，又能以响应的方式在线粒体中释放CO。带正电荷的TPP阳离子由于其静电和亲脂性吸引线粒体膜，是一种很好的线粒体靶向分子。此外，金属羰基化合物能够通过类Fenton反应，ROS响应分解为CO。作者将TPP衍生物[3-羧基丙基三苯基溴化膦(TPP-COOH)]与金属羰基化合物(FeCO)偶联，合成了前药FeCO-TPP。为了保护FeCO-TPP前药并将其运送到肿瘤细胞中进行后续线粒体靶向，作者利用带负电荷的MSN包覆带正电荷的FeCO-TPP，利用EPR效应进行肿瘤靶向传递，然后静电组装包覆一层HA(CD44的受体)来识别过表达CD44蛋白的肿瘤细胞。所合成的单分散二氧化硅具有均匀的粒径(约70nm)、良好的分散性和高负的表面电位，有利于前药负载和HA包覆。从图中可以发现，在单分散二氧化硅表面覆盖了一层较薄的低对比度HA(约15nm)。SEM图像和DLS数据显示，合成的FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物保持了良好的分散性，由于HA涂层，其水化直径略有增加。FeCO-TPP@MSN的高正电势使其易于静电组装，导致HA涂层使合成的FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物的表面电位接近中性，并防止FeCO-TPP前药和HA涂层在水溶液中高稳定性的泄漏)。
FeCO-TPP@MSN@HA能够在到达肿瘤部位后识别/粘附到肿瘤细胞上，然后在被溶酶体吞入过程中脱去HA。为了证实这一顺序过程，包括靶向肿瘤组织的纳米药物递送，靶向肿瘤细胞的纳米药物递送，对酸敏感的前药释放，靶向线粒体的前药递送，首先在体外模拟条件下研究FeCO-TPP@MSN的酸/ ROS响应释放行为。FeCO-TPP@MSN在pH7.4的PBS溶液中相当稳定，但在pH6.8的微酸溶液中，FeCO-TPP前药的释放急剧，较高的酸度导致前药释放更快。这种酸响应行为来自于与带正电荷的FeCO-TPP前药物的质子交换。MSN表面的许多硅醇基团(Si─OH)可以电离成硅酸盐(Si─O−)吸附FeCO-TPP+，也可以在酸性条件下质子化脱附/释放FeCO-TPP+。作者进一步研究了不同浓度·OH下释放的FeCO-TPP前药对ROS的响应性CO释放行为以模拟线粒体富集ROS的微环境。在·OH存在的情况下，FeCO-TPP由于·OH的强烈氧化而分解为CO。根据肿瘤的Warburg效应，·OH浓度越高，CO释放越快，对恶性肿瘤细胞的影响越强烈。
利用激光共聚焦对体外连续多阶段靶向释放和细胞控释过程进行了评价。首先，分别用红罗丹明B异硫氰酸酯(RITC)和8-巯基喹啉(QL)标记MSN载体和FeCO-TPP前药构建FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物进行荧光示踪。HeLa和4T1细胞在相同条件下与其他癌细胞相比，可以更有效地吞入FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物，因为它们的CD44显著过表达。同时，纳米药物很少被正常的MCF-10A和人类胚胎肾(HEK)293T内吞，因为CD44正常低表达的细胞，因此该纳米药物可以专一靶向CD44过表达的癌细胞，并进行靶向给药。作者选择具有最高识别性的HeLa细胞进行进一步靶向释放和控释阶段的研究。HeLa细胞内吞FeCO-TPP@MSN@HA后，主要位于溶酶体，主要体现在绿色和红色合并成黄色。蓝色逐渐出现，表明FeCO-TPP前药从纳米药物在溶酶体的酸性环境中的持续释放。为了追踪前药在线粒体内的靶向性，我们在与纳米药物共孵卵后，用绿色MitoTracker染料对HeLa细胞线粒体进行染色。将MSN载体和FeCO-TPP前药分别用红色RITC和蓝色QL标记，构建FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物进行荧光示踪。为了便于区分药物释放监测的颜色，我们将共焦图像中的线粒体和MSN通道分别设置为红色和绿色。红色和蓝色的出现产生了紫色，代表前药在线粒体内的积累。紫色的增加代表线粒体，对释放的FeCO-TPP前药的摄取。随着前药在溶酶体中从纳米药物释放，前药通过TPP分子识别逐渐积累到线粒体中，表现为线粒体靶向前药传递阶段。FeCO-TPP前药的线粒体靶向能力归功于其与线粒体膜的静电和亲脂性吸引，为线粒体响应性CO释放提供了机会。荧光COP-1(CO probe -1)探针用于检测细胞内CO释放。随着孵育时间的增加，绿色荧光强度的增强反映了CO在HeLa细胞中释放的增加,当FeCO-TPP前药到达HeLa细胞线粒体时，线粒体内ROS触发了CO的释放，这是由于其ROS响应行为。以上四个方面的研究结果证实了多阶段顺序靶向释放和控释过程。
选择两个肿瘤细胞系(HeLa和4T1)和两个正常细胞系(HEK-293T和MCF-10A)研究FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物的体外抗癌性能。FeCO-TPP，FeCO-TPP@MSN和FeCO-TPP@MSN@HA对两种癌细胞均表现出剂量和时间依赖性的细胞毒性行为，但在0-100 mg/ml浓度范围内，尽管孵育时间较长，对正常细胞的毒性不显著。与FeCO-TPP和FeCO-TPP@MSN相比，FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物在相同的孵育浓度和时间下对癌细胞的损伤最大，这可能与靶向给药有关。 FeCO-TPP@MSN@HA对HeLa和4T1细胞的ED50分别为82.6和41.5mg/ml)。作者还使用CORM-3作为CO供体来测量ED50值在HeLa和4T1细胞上CO的浓度分别为147.3和110.9mM。尽管CO持续释放，FeCO-TPP@MSN@HA仍容易快速达到足够高的CO浓度杀灭肿瘤细胞。FeCO-TPP@MSN@HA的细胞毒性随着孵育时间的延长而显著增加，甚至高于游离前药FeCO-TPP。这可能是由于HA介导的靶向抑制正常细胞对FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物的摄取和/或CO的保护作用。作者还从细胞能量代谢的角度研究了纳米药物的癌症选择性机制。, MSN几乎没有影响腺苷5 '三磷酸腺苷(ATP)含量的HeLa和MCF-10A细胞,而FeCO-TPP FeCO-TPP@MSN,和FeCO-TPP@MSN@HA显著抑制ATP的HeLa细胞水平按照线粒体数量减少,导致抗癌的结果。此外，细胞内乳酸水平FeCO-TPP@MSN@HA治疗后明显增强，表明在糖酵解过程中有氧呼吸的HeLa细胞被CO抑制，而无氧呼吸和乳酸消耗被激活,导致HeLa细胞ATP水平下降。虽然FeCO-TPP和FeCO-TPP@MSN也抑制了MCF-10A细胞的ATP水平，但线粒体数量并没有减少，这可能是因为从其泄漏的带正电荷的FeCO-TPP和FeCO-TPP@MSN和/或CO容易被内吞噬，从而在一定程度上影响线粒体功能，而中性的FeCO-TPP@MSN@HA不泄漏CO则不会。FeCO-TPP@MSN@HA对MCF-10A细胞的ATP水平和线粒体数量均无影响，因为它具有识别CD44的能力，反映了对正常细胞的低细胞毒性。基础呼吸情况与ATP产生情况相似，但经FeCO-TPP@MSN和FeCO-TPP@MSN@HA处理的MCF-10A细胞的最大呼吸和质子泄漏仍保持不变，进一步说明了保护作用。综上，FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物损害了癌细胞线粒体功能，但保护了正常细胞的线粒体，维持正常的能量代谢。
在静脉注射FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物用于肿瘤治疗之前，首先静脉注射FeCO-TPP@MSN@HA后检查其血液安全性与PBS对照、MSN载体、FeCO-TPP前药和FeCO-TPP@MSN进行比较，其中包含等量的MSN和FeCO-TPP。采集不同时间点(注射后1、7、20天)的血样进行测定。与PBS对照相比，相同剂量的MSN载体、FeCO-TPP前药和FeCO-TPP@MSN,FeCO-TPP@MSN@HA在注射后20天内(治疗时间相同)未对肝脏和肾功能造成重大损害。此外，白细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞体积分布宽度等标准血液学指标水平无明显差异，表明FeCO-TPP@MSN@HA具有较高的血液相容性。使用FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物进行体内治疗，分别使用携带B16和4T1肿瘤的小鼠模型。首先，研究了肿瘤靶向传递行为。从体内荧光成像结果可以发现，游离的FeCO-TPP快速排出，瘤内积累很少，而MSN和FeCO-TPP@MSN@HA均能有效积累到肿瘤中。从CD31染色(绿色血管)的肿瘤切片显示，FeCO- TPP@MSN@HA纳米药物溢出，并与封装的FeCO- tpp前药一起渗透到肿瘤细胞中，表明所研究的肿瘤的EPR效应和纳米药物对肿瘤的有效靶向传递。B16荷瘤肿瘤小鼠随机分为5组(n = 5)静脉注射PBS控制,MSN载体), FeCO-TPP前体药物, FeCO-TPP@MSN和FeCO-TPP@MSN@HA，分别等摩尔浓度的MSN或FeCO-TPP。从治疗结果来看，MSN载体对B16荷瘤小鼠的肿瘤生长没有影响。相比之下，FeCO-TPP在治疗20天后虽无肿瘤靶向能力，但对肿瘤生长有轻微抑制作用，而FeCO-TPP@MSN由于其被动作用，在一定程度上增强了肿瘤治疗效果目标的行为。此外，FeCO-TPP@MSN@HA可以进一步提高肿瘤治疗疗效由于其被动和主动目标概要文件。的H&E染色肿瘤切片进一步证实FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物可以消除肿瘤细胞最有效而FeCO-TPP和FeCO-TPP@MSN。各治疗组对心、肝、脾、肺、肾等主要脏器均未造成明显损伤，说明治疗剂量时生物相容性良好。用FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物治疗的小鼠没有明显的体重减轻，这表明健康状况良好。
用4T1乳腺癌细胞建立肿瘤肺转移模型，并进行荧光标记，以评价FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物的抗转移疗效。从图可以看出，原发性4T1肿瘤的治疗结果与上述B16肿瘤的治疗结果相似。MSN和FeCO-TPP对原发性4T1肿瘤的生长均无明显影响，FeCO-TPP@MSN在一定程度上抑制了它们的生长，其中FeCO-TPP@MSN@HA对肿瘤的主要抑制作用最为明显且持续时间最长(大于46天)，说明其具有被动靶向功能和主动靶向功能的贡献。相应地，4T1荷瘤小鼠的存活率显著提高。
总结
本文通过将FeCO-TPP前药与单分散的MSN结合，已开发出一种智能的肿瘤组织细胞/线粒体靶向递送平台增强肿瘤治疗。FeCO-TPP前药既保持了ROS触发的CO释放活性，又能有效靶向线粒体进行CO治疗。将FeCO-TPP前药包埋在MSN中，可显著增强其生物相容性，并通过EPR效应被动靶向肿瘤组织。构建的FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物旨在通过HA的CD44识别实现肿瘤细胞靶向。体外荧光实验证实了肿瘤组织细胞/线粒体靶向递送和随后的前药/CO触发释放。细胞能量代谢表明纳米药物增强了对癌细胞线粒体功能的损害，但保护了正常细胞的线粒体功能，维持正常的能量代谢。FeCO-TPP@MSN@HA纳米药物增强了CO治疗，显示出对肿瘤生长和转移的有效抑制。本文提出的多阶段组装/解组装策略为癌症治疗中CO的高效传递提供了一条新的途径。
参考文献
A multistage assembly/disassembly strategy fortumor-targeted CO delivery， Jin Meng, Zhaokui Jin, PengheZhao, Bin Zhao, Mingjian Fan, Qianjun He*，Sci. Adv. 2020; 6: eaba1362. DOI：10.1126/sciadv.aba1362. https://advances.sciencemag.org/content/6/20/eaba1362/tab-pdf
