内容提要
通过将NO结合的Fe−S团簇掺入脱铁蛋白腔体，构建了具有高负载效率的光活性NO释放系统。该系统保持了完整的核-壳结构，显示具有强的稳定性、降低细胞毒性、高效的细胞摄取和光控NO释放等优点。
在pH恒定为7.4的10%乙腈/PBS缓冲液中，以铁原子与蛋白质的摩尔比为500:1，将RBS负载到脱铁蛋白中。用10%乙腈/PBS透析，再用PD-10柱纯化，得到一个棕色的RBS-蛋白复合物(RBS-NP)溶液。通过KMnO4氧化法和电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)分析，估计每个蛋白质的Fe负载量分别为213和201个原子。以醋酸铀酰为阴性染色剂，通过HR-TEM证实了RBS-NP完整的结构，与脱铁蛋白相似，显示透明的外壳和致密的核被醋酸铀酰染色。非染色的HR-TEM，RBS-NPs可见为与蛋白腔大小相当的斑点。在笼内大量积累了RBS，可能是由于Fe- S簇与组氨酸、精氨酸和色氨酸等氨基酸残基的相互作用以及笼内疏水环境。RBS-NPs的平均水合直径略大于脱铁蛋白(12.9±2.6nm vs 10.0±0.9 nm)。圆二色(CD)光谱中193 nm处的正峰和208、222 nm处的负峰均为常数，说明RBS掺入过程确保了蛋白壳的α-螺旋和β片保持在原始状态。
白光LED照射(12mW/cm2, 60 min)使NO完全释放后，RBS在320 ~ 500 nm范围内的吸收带在PBS (pH 7.4)中消失。光照射引起了RBS-NP的吸收光谱相同的变化，这表明Fe−NO键被掺入过程打断，并保持了光活性。RBS和RBS-NP的NO积累呈线性时间依赖性，其稳定速率分别为4.6μM/min和3.3μM/min。由于RBS在水介质中的稳定性有限，即使小心地保护不受光，在RBS溶液中也很容易检测到NO。在RBS-NP溶液中，初始NO水平明显降低，表明RBS在疏水环境中笼化提高了RBS的稳定性。因此，RBS-NP可作为一种光控释放NO的平台而不会对笼状结构造成损伤。
因为Fe - S团簇被笼化而不是被脱铁蛋白外壳吸收，所以脱铁蛋白材料的细胞内化不会受到Fe - S团簇的影响。作者对两种肿瘤细胞系HeLa和MCF-7进行了体外光活性和毒性实验。RBS-NP 16 h的细胞培养，用PBS洗涤，DCF-FM DA染色，白光LED曝光(12 mW /cm2)30分钟。在荧光显微镜下，RBS-NP处理的HeLa细胞的亮绿色图像反映了有效的细胞摄取和光诱导的NO释放。经过RBS或RBS-NP处理的MCF-7细胞和光处理后，其荧光强度明显降低，可能是由于细胞内清除反应的存在缩短了NO寿命。为了研究细胞反应是否与细胞内氧化应激水平有关，我们使用荧光反应氧物种(ROS)探针DCFH-DA对H2O2处理的HeLa和MCF7细胞进行了成像，无论光照与否。光暴露不影响ROS水平。与HeLa细胞不同，MCF-7细胞在H2O2的作用下表现出ROS水平的抑制，而HeLa细胞则表现出细胞内ROS水平的升高。因此，氧化应激反应似乎存在细胞类型依赖机制。
MTT法测定了RBS和RBS-NP在黑暗条件下的细胞毒性。在0.5、1、2、3、4、6、8和10μg/mL铁浓度下，分别用RBS或RBS-NP处理HeLa和MCF细胞48h，然后进行MTT实验。在HeLa细胞中，RBS和RBS-NP的IC50值分别为3.7和5.4μg/mL Fe。在MCF-7细胞中，也观察到相对于RBS，暗色RBS-NP的细胞毒性降低。对于正常细胞，RBS和RBS-NP在人肝细胞QSG细胞上表现出类似的铁浓度依赖性的存活率，IC50值增加到约10μg/mL。此外，研究了NO释放对HeLa和MCF-7细胞的光毒性作用。细胞治疗与RBS或RBS-NP铁剂量为1.0μg/mL16 h，然后被白光LED曝光(12mW/cm2)不同分钟(0、5、10、15、20、25、30分钟)，与PBS再孵育24小时。用脱铁蛋白处理HeLa细胞，或光处理，或暗处理RBS，或暗处理RBS-NP均不影响细胞活力。RBS或RBS-NP处理过的MCF-7细胞表现出更高的光照耐受性，这是由于上述MCF-7细胞中细胞内氧化应激的抑制。细胞以不同的途径吸收RBS和RBS-NP。小尺寸疏水的RBS具有细胞膜通透性，而RBS-NP只能通过受体介导的内吞作用内化，导致铁摄取速率的差异。HeLa和MCF细胞治疗由RBS和在同一初始RBS-NP铁浓度(3μg/mL)在无血清培养基远离光1或2 h。对于HeLa细胞，在孵育后1 h和2h, RBS-NP处理导致铁的摄入量分别比RBS多14和5.3%；对于MCF-7细胞，在1和2小时内，RBS-NP处理比RBS分别增加了18和12%的铁摄入量。因此，RBS的吸收可以通过笼状策略增强。
结论
作者在pH 7.4下将光活性Fe-S团簇加入脱铁蛋白的笼子内部，避免了传统的蛋白质分解重组过程。体积庞大的RBS复合物以42%的负载效率封装。疏水蛋白笼对水敏感的RBS具有显著的稳定性，纳米级复合材料可保存在PBS缓冲液中，且至少有2个月的保质期。RBS复合材料的高效细胞摄取和光控NO释放特性允许细胞类型依赖性的药物应用于基于NO的治疗。
参考文献
ProteinNanocage-Based Photo-Controlled Nitric Oxide Releasing Platform, Xiao Li, YajieZhang, Jian Sun, Weijian Chen,Xuewei Wang,FenliShao,Yuyu Zhu,Fude Feng*, Yang Sun*，ACS Appl. Mater. Interfaces, 2017, 9,19519−19524.DOI: 10.1021/acsami.7b03962.
