内容提要
肿瘤的精确治疗越来越受到重视。γ-谷氨酰转肽酶(GGT)是肿瘤中显著上调表达的生物标志物。作者开发了一种GGT响应的近红外(NIR)纳米粒子，用于肿瘤特异性荧光成像引导的光热治疗。GGT响应性近红外探针NRh-G自发聚集成纳米粒子NRh-G-NPs。该纳米粒子经与GGT特异反应荧光增强约180倍，并表现出良好的光热效应。在激光照射下，NRh-G-NPs可以选择性地照亮U87MG肿瘤细胞并进行消融。在荷瘤小鼠体内静脉注射NRh-G-NPs后，NRh-G-NPs可以到达肿瘤区域并特异地照亮肿瘤，对U87MG肿瘤中过表达的GGT有特异性反应，选择性地照亮肿瘤进行成像引导治疗。在激光照射后，肿瘤可完全清除，40天内无肿瘤复发。
结果与讨论
NRh-G的结构由GGT特异性底物γ-Glu和近红外花菁荧光团NRh-NH2组成。氨基酸γ-Glu作为GGT识别底物被广泛应用，可被GGT特异性识别和切割。NRh-NH2在740 nm处具有较强的荧光，随后与Boc-Glu-OtBu反应生成中间产物NRh-G-Boc，通过Boc脱保护反应生成最终产物NRh-G。NRh-G-NPs进入GGT高表达环境后，γ-Glu部分被特异性识别并裂解。将NRh-G-NPs转化为NRh-NH2-NPs，在714nm处有近红外吸收峰，在740 nm处有荧光恢复。TEM图像显示单分散的NRh-G-NPs，尺寸约为50nm。经GGT处理后，NRh-NH2-NPs的大小减小到20-30nm。DLS测量的水动力学尺寸从90 nm 降至70nm，Zeta电位也从-0.3 mV改变到6.0mV。用GGT处理30分钟，在714nm处出现紫外吸收峰。随着孵育时间(0~ 30 min)和GGT浓度(0~ 1.0 U/L)的增加，740 nm处的荧光发射逐渐增加。
NRh-G-NPs在U87MG细胞中的细胞毒性表明，不同浓度的NRh-G-NPs在0 ~ 57.6 μg/mL范围内的细胞存活率均超过90%，表明NRh-G-NPs适合用于活细胞成像。用NRh-G-NPs检测活细胞中GGT的活性。首先，在NRh- G-NPs作用下，U87MG细胞的荧光随时间逐渐增强，在20分钟左右达到稳定值。作者用特定的GGT抑制剂(azaserine)对U87MG细胞进行预处理，然后与NRh-G-NPs (5.8 μg/mL)孵育20分钟，经抑制剂预处理的细胞的荧光信号明显下降。当高酶表达的U87MG细胞与NRh-G-NPs孵育20 min时，观察到强烈的荧光信号。而相同时间的NRh-G-NPs处理低酶表达L02细胞显示出较弱的荧光。当L02细胞用GGT促进剂预处理，然后与NRh-G-NPs共孵育20分钟时，观察到荧光信号增强。因此，NRh-G-NPs可以区分正常细胞和癌细胞，而且确实具有GGT特异性。由于GGT是氧化应激的早期敏感标记物，作者研究了GGT与潜在的抗癌药物NaBu协同诱导细胞氧化应激的作用。预处理细胞中NaBu浓度越高，与NRh-G-NPs孵育后的荧光强度越强。同时，高浓度NaBu预处理后死细胞比例显著增加。因此，抗癌药物NaBu和NRh-G-NPs可以同时用于癌症的诊断和治疗。
通过尾静脉将纳米颗粒注射到U87MG荷瘤裸鼠体内，评价NRh-G-NPs对体内肿瘤的被动靶向能力。采用生物发光成像系统监测全身荧光。从图可以看出，在注射NRh-G-NPs的小鼠肿瘤中，荧光逐渐增加，在1.5 h时荧光最强，随后在注射5h后荧光开始减弱并完全消失。定量分析显示，注射NRh-G-NPs的小鼠的信噪比(SNR)在1.5h内显著上升，然后开始下降。注射NRh-G-NP 1.5 h后解剖小鼠，切除心脏、脾脏、肿瘤、肺、肠、肾、肝进行生物成像。与其他器官相比，肿瘤的荧光非常强。切片肿瘤组织后也进行共聚焦成像。对深度为35μm的U87MG肿瘤组织切片进行三维重建。结果表明，NRh-G-NPs通过被动靶向肿瘤定位，可用于肿瘤中GGT的有效实时无创成像。
当GGT特异性切断NRh-G-NPs的氨基酸链时，产物NRh-NH2-NPs在730nm激光照射下表现出光热效应和730 nm激光照射下的光热效应。不同浓度的NRh-G-NPs加入或不加入1.0U/L酶孵育20 min，然后在730nm (1.0 W/cm2)激光照射下孵育5min。激光照射下，未加GGT处理的不同浓度NRh-G-NPs的温度没有明显变化。而在相同激光照射条件下，酶培养后的升温速度和最终达到的温度与NRh-G-NPs的浓度成正比。图中的NRh-G-NPs(34.6μg/mL)在730 nm激光照射5分钟后的红外热像图如图，同时也证实了NRh-NH2-NPs具有良好的光热稳定性。不同浓度的NRh-NH2在730 nm激光照射5分钟，通过监测了温度的变化，NRh-G-NPs与GGT的反应产物具有优良的光热性能。
NRh-G-NPs对U87MG癌细胞无明显的细胞毒性，即使在高达57.6 μg/mL的蛋白浓度下也无明显的细胞毒性，作者使用730 nm激光照射不同浓度的NRh-G-NPs孵育的细胞。随着NRh-G-NPs浓度的增加，细胞存活率显著降低。激光照射后NRh-G-NPs孵育细胞的死亡率较高，GGT抑制剂预孵育后细胞死亡率下降。因此，钙黄素和碘化丙啶共染色细胞的MTT检测和倒置荧光成像进一步证实了NRh-G-NPs对U87MG细胞的有效和特异性光热消融作用，在特定条件下能体外杀伤肿瘤细胞。
基于NRh-G-NPs在体内对肿瘤的被动靶向及其强近红外吸收，我们在小鼠U87MG细胞皮下肿瘤模型上进行了体内光热治疗的研究。采用红外热像仪每隔1min直接监测小鼠体温。在静脉注射NRh-G- NPs或生理盐水1.5h后，小鼠暴露于730采用红外热像仪监测温度。注射NRh-G-NPs的小鼠，在激光照射下肿瘤表面温度从36°C迅速上升到54°C。在相同的照射条件下，其他各组小鼠的肿瘤温度没有明显变化。H&E染色的肿瘤切片组织学检查显示，在激光照射后，只有NRh-G-NPs注射组的肿瘤结构严重受损。治疗组(NRh-G-NPs+激光)小鼠肿瘤经过2天的光热治疗完全消融，观察期间未见肿瘤再生。注射生理盐水或NRh-G-NPs，或仅注射相同功率的激光照射对肿瘤生长没有影响。治疗后1天解剖肿瘤的照片显示，NRh-G-NPs + Laser组肿瘤明显缩小，而其他三组肿瘤体积增大。治疗14 d后，4组小鼠均处死，切取主要脏器进行H&E染色。结果显示，器官没有受到任何明显的损伤。四组小鼠的体重也没有异常变化。与3个对照组的平均寿命相比，经过NRh-G-NPs诱导的光热治疗的小鼠存活超过40天。NRh-G-NPs可以在动物模型中有效、准确地治疗肿瘤而不损伤其他器官。
结论
作者合成了一种能特异性检测和治疗恶性肿瘤的γ-谷氨酰转肽酶激活的近红外纳米粒子NRh-G-NPs，在血液循环过程中不表现出荧光或光热效果。EPR效应导致肿瘤高聚集，被肿瘤部位高表达的酶GGT激活，生成的NRh-NH2-NPs显示出强大的荧光发射，可用于肿瘤诊断，并在光热治疗中显示出优异的光热转换特性。体内和体外实验均证明了NRh-G-NPs对肿瘤治疗的特异性和有效性，在荧光成像引导的光热治疗中具有巨大的潜力。
参考文献
γ-Glutamyl transpeptidase-activatable near-infrared nanoassembly for tumor fluorescence imaging-guided photothermal therapy, Fangyuan Zhou, Shikui Yang, Chao Zhao, Wangwang Liu,Xufeng Yao, Hui Yu, Xiaolian Sun*, Yi Liu*, Theranostics, 2021, 11, 7045-7056. DOI:10.7150/thno.60586. https://www.thno.org/v11p7045.html.
