内容摘要
干扰素基因刺激因子(STING)信号通路激活不足和深度免疫抑制微环境在很大程度上限制了肿瘤免疫治疗的效果。在此，我们利用肿瘤微环境(TME)反应纳米颗粒(PMM NPs)同时利用STING和toll样受体4 (TLR4)，通过TLR4介导的核因子- κ B信号通路刺激增强STING的激活，导致I型干扰素(即IFN-β的4.0倍增强)和促炎细胞因子的分泌增加，从而促进特异性T细胞免疫反应。此外，PMM NPs通过降低treg的百分比，并使M2型巨噬细胞极化为M1型，从而减轻TME的免疫抑制，从而产生免疫支持性TME，从而释放级联性适应性免疫反应。联合抗pd -1抗体，在炎症性结直肠癌和非炎症性转移性乳腺肿瘤模型中均取得协同效应。此外，用低渗细胞重新挑战无肿瘤动物诱导完全的肿瘤排斥反应，表明产生了全身抗肿瘤记忆。这些响应tme的纳米颗粒可能为实现STING激活的时空协调开辟了新的途径，为下一代癌症免疫治疗提供了有前途的临床候选药物。
结果与讨论
采用液相法首次制备了油溶性超小Mn3O4纳米粒子。Mn3O4纳米粒子的x射线衍射图显示出32°、36°和59°的宽衍射峰，与四边形Mn3O4(JCPDS #24-0734)的标准反射峰相匹配。透射电子显微镜(TEM)显示Mn3O4NPs的直径为7.4±1.2 nm。通过自组装方法制备了负载不同载物的超pH敏感(UPS)纳米材料，纯NPs(无激动剂)，PMO NPs(只有Mn3O4 NPs)，PMP NPs(只有MPLA)和PMM NPs(双激动剂)。PMM NPs的Mn3O4NPs与MPLA的质量比优化为4:1，相应的负载含量分别为21.05%和5.26%。TEM显示了PMM NPs的表面形貌，其中Mn3O4纳米颗粒在pH=7.4时被包裹到UPS纳米颗粒中，并在pH=6.5时由于PEPA (pKa 7.0)的质子化而被分解元素映射证实了PMM NPs中存在Mn、N和O元素。动态光散射测量表明，PMM NPs的水动力直径为20-30 nm，正电荷约为20 mV。此外，PMM NPs在pH 7.4的PBS溶液中保持稳定超过一周。
接下来，我们分别用电感耦合等离子体(ICP)和高效液相色谱法研究了锰离子和MPLA在不同pH下的释放。结果表明，在pH为5.5和6.5时，MPLA分别在2和6小时内从PMM NPs中完全释放，而在pH为7.4时，MPLA的释放量最小。Mn3O4 NPs在不同pH下的释放及进一步转化为锰离子的过程如图所示。在pH为5.5、6.5和7.4时，96 h锰离子的检出率分别为98.6%、62.7%和31.8%。这主要是因为Mn3O4 NPs在酸性条件下以H+浓度依赖的方式酸化成锰离子。这些结果表明，在体循环过程中，PMM NPs在中性pH下保持完整的胶束状态，并在暴露于酸性肿瘤环境时解离成分子，在酸性肿瘤环境中，被封装的货物被释放，从而允许先天刺激的时空协调。
随后研究了PMM NPs在骨髓源性树突状细胞(bmdc)上的细胞内递送和免疫刺激作用。为了分析细胞摄取，将BMDCs与荧光染料cy5标记的PMM NPs共培养30分钟。荧光显微镜下观察到强烈的红色荧光信号，表明PMM NPs主要通过小窝蛋白和微胞饮介导的途径内化到BMDCs中。此外，我们还研究了BMDCs中PMM NPs释放的Mn3O4和MPLA的内吞作用。为此，我们分别制备了含有Mn3O4 NPs和fitc标记的MPLA的PMM NPs。将PMM NPs用pH = 6.5的PBS预处理后，与BMDCs共培养，分别用流式细胞术和ICP检测细胞内MPLA和锰离子。结果表明，BMDCs有效地内化了释放的MPLA和Mn3O4NPs。
树突状细胞的成熟和激活对于启动免疫反应和触发后续免疫反应至关重要为此，我们收集BMDCs并将其与PMM NPs共培养48小时，然后使用流式细胞术评估DC成熟度。与其他纳米颗粒相比，PMM NPs显著上调了共刺激分子CD86和CD80的表达，表明TLR和STING通路的双重激活诱导了DC成熟。此外，我们检测了不同NPs刺激下细胞因子的分泌。正如预期的那样，PMM NPs组的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌分别是PBS、Pure NPs、PMO NPs和PMP NPs组的10.9倍、14.3倍、8.9倍和2.0倍。干扰素-γ(IFN-γ，类型Ⅱ干扰素)促进TH1型免疫应答并诱导细胞毒性CD8+ T细胞的产生结果显示，与其他组相比，PMM NPs显著诱导IFN-γ产生。总之，这些结果表明，协同激活TLR4和STING信号通路比单一激动剂更显著地诱导BMDCs的激活和成熟，这对随后的癌症治疗免疫应答很重要。
STING通路的激活诱导IFN-I和促炎因子的分泌，进而启动适应性免疫以增强癌症免疫治疗。干扰素-β(IFN-β)通过促进dc的成熟和交叉呈递，提高细胞毒性T淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞的效力，在癌症免疫治疗中至关重要为了验证关键指标IFN-β在STING通路激活过程中的分泌情况，我们将BMDCs与不同的纳米颗粒孵育48小时。结果显示，PMO NPs处理的细胞中，IFN-β的分泌可以忽略不计，而PMM NPs比PMO NPs显著提高IFN-β的分泌(增强4.0倍)，表明激动剂MPLA显著放大了Mn2+介导的STING- i型信号通路激活。RAW-LuciTMISG细胞用于检测STING通路的激活以及Mn3O4NPs与MPLA之间的协同作用。结果显示，与PMO NPs和PMP NPs相比，PMM NPs显著激活了STING通路，其组合指数值为0.24，表明PMM NPs中的MPLA和Mn3O4对STING激活具有协同作用。RAW-Blue™细胞用于研究TLR通路，该通路稳定表达胚胎分泌碱性磷酸酶(SEAP)，并可通过QUANTI-Blue™溶液检测，PMP NPs对SEAP分泌的刺激明显高于PBS、Pure NPs和Free MPLA，说明将MPLA配制成UPS纳米颗粒可以显著增强TLR4信号通路的激活。作为TLR4激动剂，MPLA可以诱导NF-κB信号通路的激活，通过阻止微管介导的STING溶酶体降解来增强STING信号通路，进一步增加IFN-β的产生，用于癌症免疫治疗。在此基础上，我们利用Western blot和荧光显微镜研究了装载TLR4和STING激动剂的PMM NPs是否可以协同激活下游信号通路。与其他组相比，PMM NPs提高了STING、TBK-1和IRF3的磷酸化水平，并提高了STING总蛋白水平。采用核易位检测试剂盒检测NF-κB向细胞核的主要亚基p65转运，作为评估NF-κB通路激活的一种方法。结果显示，PBS和纯NPs组Cy3荧光-p65仅在细胞质中定位，而PMO NPs和PMP NPs处理可促进NF-κB转运到细胞核中。PMM NPs显著激活NF-κB通路，在所有组中显示出最显著的核荧光。易位细胞的百分比比PMO NPs高3.6倍。总的来说，PMM NPs导致tlr4诱导的NFκB活化，从而增强STING介导的免疫反应的强度，协同促进IFN-β和炎症细胞因子的分泌，从而实现强大的癌症免疫治疗。在那之后，我们试图探索其在体内抑制肿瘤生长的潜力。
我们首先研究了cy5标记的PMM NPs在荷瘤小鼠全身给药后的肿瘤靶向性。体内和离体成像均显示，除肝脏外，肿瘤部位均有明亮的荧光信号，由于非酸性环境，肝脏未引起潜在的自身免疫反应，提示UPS纳米材料优先向肿瘤组织积累，同时避免了佐剂在血液循环中渗漏引起的安全性问题。随后，我们通过向BALB/c小鼠静脉注射cy5标记的PMM NPs来研究其药代动力学特征。纳米颗粒浓度随时间变化，注射后24小时仍可在小鼠体内检测到。24 h内血浆浓度-时间曲线呈现两相行为，α-相半衰期(t1/2， α)为0.9±0.1 h， β-相半衰期(t1/2， β)为18.4±1.7 h。
受PMM NPs强大的体外免疫应答、肿瘤靶向递送和tme活化药物释放的鼓舞，我们接下来在MC38结肠肿瘤模型中研究了PMM NPs的抗肿瘤功效。在肿瘤接种后第7天，用PBS、纯NPs、抗pd -1抗体、游离MM(游离Mn3O4 NPs和MPLA)、游离MM+抗pd -1抗体、PMO NPs、PMP NPs、PMM NPs和PMM NPs加抗pd -1抗体处理小鼠。与PBS对照组相比，纯NPs组和单一抗pd -1抗体组对肿瘤生长无明显抑制作用。PMO NP组和PMP NP组对肿瘤有轻微抑制作用。与PMO NPs和PMP NPs相比，PMM NPs具有更强的抗肿瘤作用，能显著抑制肿瘤生长，延长肿瘤植入小鼠的生存期。PMM NPs进一步与抗pd -1抗体联合使用显示出协同作用，在60%的小鼠中基本上消除了肿瘤。此外，肿瘤的苏木精-伊红(H&E)染色显示，PMM NPs联合抗pd -1抗体比其他组更能诱导肿瘤细胞凋亡和坏死。在任何组中均未观察到明显的体重减轻。此外，静脉注射各种纳米颗粒后，肝脏、心脏、肺、脾脏和肾脏的组织学染色也未显示出明显的短期全身毒性，表明UPS纳米材料具有良好的生物安全性。
此外，我们在第40天对无肿瘤小鼠进行MC38肿瘤细胞再攻毒。结果显示，PMM NPs加抗pd -1抗体处理的无瘤小鼠对新注射的肿瘤细胞具有耐药性，而pbs处理的小鼠肿瘤生长迅速。然后我们分离脾脏并用流式细胞术分析记忆T细胞。PMM NP +抗pd -1抗体处理显著提高了CD8中枢记忆T细胞(TCM、CD44+ CD62L+细胞)的百分比(38.4%，PBS组为17.6%)，说明小鼠在遇到肿瘤细胞时，迅速启动记忆细胞并分化为抗肿瘤的CD8效应细胞，完全抑制肿瘤生长。这些结果表明，PMM NPs产生强大的STING激活，抑制癌症，并进一步与抗pd -1抗体联合，不仅可以使肿瘤完全消退，还可以诱导长期的免疫应答。
受PMM NPs优越的抗肿瘤免疫应答的启发，我们接下来探讨了其背后的详细机制。PMM NPs诱导的瘤内细胞因子IFN-β、TNF-α和IL-2水平高于Pure NPs、PMO NPs、PMP NPs，且联合抗pd -1抗体进一步增强了分泌水平，说明IFN- i和促炎细胞因子介导了有效的抗肿瘤免疫反应，诱导肿瘤细胞凋亡和肿瘤消退。先前的体外研究表明，PMM NPs可显著促进dc的成熟和激活，从而产生初始免疫反应。为了测试PMM NPs是否在体内诱导DC成熟，我们分离淋巴结并将其接地成单细胞悬液。用fitc标记的抗CD86抗体、APC标记的抗CD80抗体和PERCP- cy5.5标记的抗cd11c抗体对细胞进行染色，流式细胞术检测CD80和CD86的百分比。与PBS、Pure NPs、PMO NPs和PMP NPs处理组相比，PMM NPs处理组DC标志物CD80+CD86+的表达明显增强，与抗pd -1抗体联合使用进一步促进DC成熟，比PBS组提高了3.1倍。总之，这些结果表明PMM NPs在体内有效诱导DC成熟，启动强大的抗肿瘤免疫反应。
NK细胞作为天然细胞毒性淋巴细胞，在抗肿瘤免疫应答中也发挥重要作用，可直接杀伤肿瘤细胞或增强适应性抗肿瘤免疫在接下来的研究中，我们还使用流式细胞术来测量脾脏和淋巴结中NK细胞的百分比。与其他组相比，PMM NPs处理明显促进了淋巴结NK细胞的活化，高达13.1%，分别是PBS、Pure NPs、PMO NPs和PMP NPs的5.9倍、4.5倍、2.0倍、1.7倍。同样，脾脏中也观察到NK细胞的活化。重要的是，与抗pd -1抗体联合进一步增强NK活化。为了研究PMM NPs在适应性免疫应答中的作用，我们接下来定量了脾脏中的CD4+和CD8+ T细胞。结果显示，PMM NPs处理后脾脏CD4+ T细胞比例分别是PBS、Pure NPs、PMO NPs、PMP NPs处理后的4.1倍、3.8倍、1.2倍和1.1倍， CD8+ T细胞比例也显著增强。PMM NPs与抗pd -1抗体的结合进一步增强了T细胞应答，提示协同作用。
免疫抑制TME有助于肿瘤对免疫治疗的抵抗Tregs通过抑制免疫微环境中的T效应细胞(Teff)功能介导免疫抑制，促进肿瘤的发生和进展大量肿瘤相关巨噬细胞(tam)转化为m2型，保护肿瘤细胞免受免疫监视并促进肿瘤发展为了明确PMM NPs是否可以逆转免疫抑制的TME，我们用流式细胞术分析了Treg和TAM在肿瘤中的表达。我们从小鼠身上剥离肿瘤，用胶原酶I和脱氧核糖核酸酶I (DNAase I)消化它们，获得单细胞悬液。结果显示，PMM NPs处理显著降低了肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中Tregs的百分比至9.5%，而PBS处理仅为29.7%，并测量了肿瘤中m1型和m2型巨噬细胞的数量。PMM NPs显著增加CD86的表达，降低CD206的表达。与PBS处理相比，M1/M2比值提高了12.6倍，说明免疫抑制的缓解增强了对免疫细胞的杀伤作用。
综上所述，PMM NPs有效的抗肿瘤免疫应答是通过多种机制介导的。一方面，PMM NPs有效激活STING和TLR4信号通路，通过DC和NK细胞成熟、CD8细胞毒性T细胞和CD4辅助性T细胞产生协同免疫激活，放大IFN-I等促炎因子的产生。另一方面，通过显著降低肿瘤组织中Tregs和极化M2巨噬细胞与M1型巨噬细胞的比例，释放级联性适应性免疫反应，从而产生免疫支持型TME，增强免疫细胞的应答，从而缓解TME中的免疫抑制。同时，进一步与抗pd -1抗体联合，破坏PD1/PD-L1信号通路，从而缓解免疫抑制，释放持久应答，抑制肿瘤生长。
受其在免疫原性MC38荷瘤小鼠中有效的鼓舞，我们进一步评估了4T1三阴性乳腺癌模型的治疗效果，该模型免疫原性差，侵袭性强，也会自发转移到远处器官。将4T1细胞接种于BALB/c小鼠乳腺，第5天用不同的治疗药物处理。纯NPs组的肿瘤生长曲线和图像与PBS组相似，表明治疗效果极小。PMO NPs或PMP NPs治疗具有中等的肿瘤抑制作用，而PMM NPs显著限制肿瘤进展，第19天的生长抑制率为76.9%。与抗pd -1抗体联用进一步增强了抗肿瘤作用，显著延长荷瘤小鼠的生存期。与PMO NPs和PMP NPs组相比，PMM NPs治疗组的肿瘤重量明显降低，证实了PMM NPs具有更强的抗肿瘤功效。随后，我们检测了纳米颗粒减少肺转移的能力。组织形态学分析显示，PMO NPs和PMP处理的小鼠存在肺转移结节，而PMM NPs处理的小鼠肺部未观察到明显的转移。各组小鼠体重几乎没有变化，说明纳米颗粒的生物安全性。这些结果表明，PMM NPs对低免疫原性4T1乳腺癌的肿瘤生长和肺转移发展具有强大的抑制作用，突出了其在癌症免疫治疗工具箱中的潜力。
为了进一步研究PMM NPs的协同抗肿瘤免疫机制，我们首先量化了淋巴结和脾脏中T细胞的表达。结果显示，脾CD4+辅助性T细胞比例从PBS组的7.8%增加到PMM NPs组的22.5%，CD8+细胞毒性T细胞比例从4.0%增加到10.4%。因此，当PMM NPs联合抗pd -1抗体时，CD4+和CD8+的比例继续增加，分别达到28.3%和12.6%。同样，PMM NPs处理的淋巴结中CD4+ T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞的比例也明显增强。值得注意的是，与PBS(13.5%)、Pure NPs(7.2%)和PMO NPs(6.5%)相比，PMM NPs治疗显著降低了Tregs的百分比(0.7%)，有效地克服了肿瘤细胞的免疫逃逸，激活了免疫细胞。
CD4+和CD8+ T细胞是IFN-γ的主要来源，IFN-γ是TIL诱导的抗肿瘤反应的重要效应物，通过直接裂解肿瘤细胞有效地消除肿瘤PMM NPs处理组的肿瘤浸润性CD4+IFN-γ+ T细胞的生成量分别是PBS、Pure NPs、PMO NPs和PMP NPs处理组的5.49-、2.47-、1.73-和1.19倍。PMM NPs处理组CD8+IFN-γ+ T细胞的产量分别是PBS、Pure NPs、PMO NPs和PMP NPs处理组的6.0倍、2.2倍、1.90倍和1.54倍。因此，PMM NPs治疗显著刺激TIL分泌IFN-γ杀死肿瘤细胞，显著抑制肿瘤生长。值得注意的是，PMM NPs诱导的IFN-β细胞因子是PMO NPs的1.58倍，进一步支持tlr介导的STING激活扩增。此外，PMM NPs处理的肿瘤中TNF-α、IL-2、CXCL-10和IL-6细胞因子水平显著高于其他组，表明STING和TLR4信号通路的双重激活促进了I型IFN和促炎细胞因子的分泌，架起了先天免疫和适应性免疫反应的桥梁。综上所述，PMM NPs增强了4T1荷瘤小鼠的CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的浸润，降低了Tregs的比例，从而提高了INF - 1和促炎细胞因子的水平，有效发挥抗肿瘤免疫作用。与抗pd -1抗体联合使用可协同增强免疫应答。
结论
总之，我们已经开发出一种精确的ph响应和肿瘤靶向纳米颗粒，通过利用TLR4和STING先天免疫途径，实现先天免疫刺激的时空协调，以协同癌症免疫治疗。TLR4激活后NF-κB的诱导增强了sting介导的免疫反应的强度，导致IFN-β和其他促炎细胞因子的分泌增加。值得注意的是，PMM NPs还通过显著降低treg的百分比，并使M2向M1巨噬细胞极化，从而减轻了TME的免疫抑制性质，从而为增强免疫细胞的作用创造了免疫支持的肿瘤微环境。我们已经在多种动物模型(包括炎症性结直肠癌和非炎症性转移性乳腺癌)中证明了它能够引发有效的抗肿瘤免疫反应，并显着增强对检查点治疗的治疗反应。总的来说，PMM NPs在放大STING级联中的免疫刺激作用诱导了强大和持续的免疫激活，并逆转了免疫抑制以释放适应性免疫反应，显示了它们在下一代癌症免疫治疗的临床转化中的巨大潜力。
参考文献
Tumor Microenvironment-Responsive Nanoparticles Amplifying STING Signaling Pathway for Cancer Immunotherapy. Dan Liu, Shuang Liang, Kongshuo Ma, Qian-Fang Meng, Xingang Li, Jian Wei, Mengli Zhou, Kaiqing Yun, Yuanwei Pan, Lang Rao,* Xiaoyuan Chen,* and Zhaohui Wang*.Adv. Mater. 2023, 2304845. https://doi.org/10.1002/adma.202304845
