内容提要
缺氧与肿瘤的增殖、侵袭、转移、耐药等密切相关，克服缺氧在肿瘤治疗中具有重要意义。在此，作者报告了一种基于超分子苝酰亚胺自由基阴离子的光热剂的缺氧诱导的特异性光热疗法（PTT）。能够在各种肿瘤中的低氧区显示出很强的还原能力，并且在这样的环境中，由二萘嵌苯二酰亚胺衍生物和葫芦脲形成的超分子复合物可以被还原成超分子二萘嵌苯二酰亚胺自由基阴离子。得益于原位生成的超分子二酰亚胺自由基阴离子的强近红外吸收和良好的光热转换性能，低氧诱导的PTT策略表现出优异的光热治疗效率以及良好的特异性和生物安全性。PTT治疗后，肿瘤组织中缺氧诱导因子的表达下降至正常水平。预计这种低氧诱导的特异性PTT策略为针对低氧肿瘤的光热治疗开辟了新的视野，具有改善的特异性和安全性。
结果与讨论
超分子复合物PDI-2CB[7]由PDI衍生物和CB[7]以1：2的摩尔比构建，CB[7]与PDI的两步结合常数测定为1.91×106和6.34×105 M−1。CB[7]包封PDI上的疏水苄基并屏蔽带正电荷的季铵基团，导致PDI-2CB[7]的细胞毒性降低。即使当浓度高达250μM时，PDI-2CB[7]对两种正常细胞BEAS-2B和LO2的细胞活力仍保持在90%以上。同时，CB[7]阻止了PDI的π−π堆积，削弱了PDI自由基阴离子的淬灭，从而提高了光热转换效率。此外，3D细胞模型横截面的共聚焦图像显示PDI-2CB[7]可以在4小时内迅速扩散到整个3D细胞模型中，表明PDI-2CB[7]避免了缺氧肿瘤中药物蓄积受限的问题。共定位实验进一步证明PDI-2CB[7]通过渗透进入肿瘤细胞。因此，超分子复合物PDI-2CB[7]的这些优点为后续的光热治疗奠定了良好的基础。
为了直接探索PDI-2CB[7]是否可以被缺氧肿瘤还原为超分子PDI自由基阴离子，进行了电子顺磁共振（EPR）光谱。在缺氧条件下，在不同肿瘤细胞的存在下观察到g因子为2.0035的EPR信号，表明形成了超分子PDI自由基阴离子。与此相反，在常氧条件下，在正常细胞的存在下没有EPR信号。氧气供应不足导致肿瘤细胞中还原性物质的积累。所产生的还原环境允许PDI-2CB[7]被缺氧肿瘤细胞原位还原。EPR信号的二重积分计算为HeLa和HepG 2细胞为1085，MCF-7、HCT 116和A549细胞为1045，表明前两个细胞中的超分子PDI自由基阴离子的浓度几乎是其他细胞中的两倍。这可能是由于细胞活性的差异。更活跃的肿瘤细胞可以积累更多的还原性物质，这与细胞培养中的细胞增殖速率一致。一旦通气，超分子PDI自由基阴离子被淬灭，EPR信号消失。PDI 2CB [7]的这种生物还原也得到了紫外维斯光谱的支持。在低氧HeLa细胞存在下，超分子PDI自由基阴离子的特征吸收带清楚地出现在818 nm处。此外，在常氧肿瘤细胞存在下发现可忽略的EPR信号。而在缺氧条件下，正常细胞BEAS 2B和LO2分别出现了具有27.7和70.5的双积分的EPR信号。上述结果表明，超分子PDI自由基阴离子可以诱导低氧细胞，而不是常氧细胞。
为了理解缺氧细胞还原PDI-2CB[7]的机制，测量了PDI-2CB[7]的微分脉冲伏安法（DPV）曲线和不同细胞的氧化还原电位。PDI-2CB[7]的第一还原峰值为−0.35 V vs Ag/AgCl，5种肿瘤细胞在缺氧条件下的氧化还原电位范围为−0.37至−0.43 V vs Ag/AgCl。由于测量的氧化还原电位归因于细胞间介质，作者认为缺氧肿瘤的实际氧化还原电位甚至更低，而在常氧条件下两种正常细胞的氧化还原电位约为−0.16 V vs Ag/AgCl，远高于PDI-2CB的第一还原峰值。这些结果有力地支持了缺氧肿瘤细胞可以减少PDI-2CB[7]的结论。以HeLa细胞为代表细胞系，进一步研究肿瘤细胞氧化还原电位与培养液中氧浓度的关系。在密封环境中，培养基中的溶解氧在4小时内从3.7 mg/mL消耗到0.2 mg/mL。在此过程中，氧化还原电位从-0.16 V降至-0.43 V（相对于Ag/AgCl）。通风后，氧化还原电位和溶解氧迅速恢复到其初始状态。至于通风环境，HeLa细胞的氧化还原电位和培养基中的溶解氧分别保持在3.0 mg/mL和-0.17 V vs Ag/AgCl。也就是说，形成超分子PDI自由基阴离子的决定性因素是缺氧微环境。
为了评估超分子PDI自由基阴离子的光热性能，进行光热转化实验，其中PDI-2CB[7]被低氧HeLa细胞还原。浓度为0.1mM的超分子PDI自由基阴离子在818 nm处的最大吸收为0.44，摩尔消光系数为4.4 × 103 L·mol-1·cm-1。在808 nm激光照射下，原位形成的超分子PDI自由基阴离子的光热转换效率计算为35.7%。然后，利用有HeLa肿瘤的裸鼠监测肿瘤在808 nm NIR照射下的温度变化。原位注射PDI-2CB[7]后，保留不同的时间间隔供PDI-2CB[7]穿透肿瘤区域并还原为超分子PDI自由基阴离子。当保留时间为30 min时，808 nm激光照射后，肿瘤温度在2 min内从37℃迅速上升至55℃，然后在随后的8 min内缓慢上升至62℃，这对于PTT来说足够高。随着放置时间的延长，由于超分子PDI自由基阴离子的充分形成，NIR照射后肿瘤温度的升高略高。当保留时间设定为60和240 min时，最终温度分别升至66和73℃。在治疗效率和随后的愈合方面，选择保留时间为60分钟用于以下实验。因此，原位形成的超分子PDI自由基阴离子在体内表现出很好的光热性能。
为了进一步探索缺氧诱导的超分子PDI自由基阴离子对小鼠的特异性，将PDI-2CB[7]注射到肿瘤和对侧相应位置的正常组织中，并在808 nm激光下照射小鼠全身。照射10 min后，仅肿瘤温度升高至65℃，周围组织温度无变化。特别地，在也注射了PDI-2CB[7]的相对部位上的正常组织保持37℃的正常体温。该结果表明，PDI-2CB[7]在正常组织中不能被还原为超分子PDI自由基阴离子，从而确保了缺氧诱导的PTT的特异性和生物安全性。
受超分子PDI自由基阴离子的优异光热性能的鼓舞，研究了体内光热治疗效率。将原位注射的HeLa荷瘤裸鼠随机分为四组：（I）对照组、（II）激光组、（III）PDI-2CB[7]组和（IV）PDI-2CB[7]+激光组。在前三组中观察到可忽略的肿瘤生长抑制，表明808 nm激光和PDI 2CB [7]单独不能抑制肿瘤生长。IV组肿瘤体积明显缩小，肿瘤体积抑制率达93%。相应的肿瘤数码照片显示出类似的抗肿瘤趋势。此外，在苏木精和伊红（H&E）染色的肿瘤组织中，在组IV中发现广泛的损伤，包括肿瘤细胞减少、组织坏死和核固缩，而在其他对照组中观察到紧密和完整的肿瘤。未观察到小鼠体重的显著减轻，表明全身毒性低。H&E染色图像还显示包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的主要器官没有严重损伤。在治疗过程中，与其他组相比，组IV中的肿瘤温度显示出近30℃的升高，导致有效的PTT。高温引起的烧伤在15天内逐渐愈合，进一步证实了其极大的生物安全性。令人兴奋的是，IV中肿瘤的HIF-1α表达从0.43 pg/mg明显降低至0.21 pg/mg，接近于正常组织的表达。可能的原因是广泛的细胞损伤使肿瘤松动并恢复氧气供应，从而减少HIF 1 α的积累。因此，治疗后肿瘤增殖和转移将受到限制。此外，充足的氧气供应关闭了超分子PDI自由基阴离子的光热性能，这可以避免残留的超分子PDI自由基阴离子可能引起的副作用。这些结果表明，缺氧可以成功地克服通过特定的PTT基于缺氧诱导的超分子PDI自由基阴离子。
随后，构建4T1荷瘤小鼠模型以进一步评估体内光热治疗效率。虽然较厚的皮毛导致肿瘤温度变化略有降低，但PDI-2CB[7]+激光组也表现出出色的抗肿瘤活性。肿瘤体积抑制率高达95%。同样，小鼠体重和组织病理学照片显示全身毒性较低，肿瘤HIF-1α表达降至正常水平。因此，这种基于超分子PDI自由基阴离子的缺氧诱导的特异性PTT在保证小鼠正常生理活动的同时有效抑制肿瘤生长。
结论
乏氧诱导的超分子PDI自由基阴离子成功地开发用于具有受控“开-关”状态的特定光热治疗。超分子PDI自由基阴离子可以通过各种缺氧肿瘤原位生物还原PDI-2CB[7]产生。特异性PTT在人和小鼠荷瘤模型中均表现出优异的光热治疗效率和生物安全性。PTT治疗后，肿瘤组织中HIF-1α的表达下降至正常水平，抑制肿瘤的增殖和转移。超分子PDI自由基阴离子可以被PTT处理后恢复的氧淬灭，从而关闭PTT。这一策略可以推广到其他类型的光热剂克服缺氧的基础上的有机自由基或超分子自由基的缺氧反应。这种低氧诱导的特异性PTT策略为针对低氧肿瘤的光热治疗开辟了新的视野，具有更高的特异性和安全性。
参考文献
In Situ Hypoxia-Induced Supramolecular Perylene Diimide Radical Anions in Tumors for Photothermal Therapy with Improved Specificity， Hua Wang, Ke-Fei Xue, Yuchong Yang, Hao Hu, Jiang-Fei Xu,* and Xi Zhang*，J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 2360−2367.https://pubs.acs.org/doi/epdf/10.1021/jacs.1c13067
