内容提要
动脉粥样硬化是一种影响动脉的慢性炎症性疾病，是心血管疾病的主要原因。动脉粥样硬化斑块的形成通常是无症状的，直到临床事件发生才表现出来。因此，动脉粥样硬化斑块的早期诊断和治疗尤为重要。本文开发了一系列用于三种光响应NO前药（RBT-NO）的NIR-II荧光染料（RBT-NH），这些前药可以由808nm激光可控触发，在临床医学“治疗窗口”中释放NO并开启NIR-II发射。值得注意的是，选择RBT3-NO是因为其表现出高的NO释放效率和优异的荧光信号增强。随后，一个仿生血小板的纳米前药系统(RBT3-NO-PEG@PM)由DSPE-mPEG5k和血小板膜（PM）构建，用于有效靶向诊断和治疗小鼠动脉粥样硬化。
实验结果与讨论
探针的合成与光物理性质研究
本文在罗丹明结构的基础上，引入苯并噻吩基杂环作为供体，扩展其共轭结构，构建分子内电荷转移（ICT）机制，使激发态的最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道的分布发生电子转移，这导致大的斯托克斯位移。此外，通过改变供体R基团的电子密度，改变其摩尔消光系数和荧光量子产率等光物理性质，合成了一系列荧光染料（RBT-NH）。随后，RBT-NH通过硝化反应制备NO前药（RBT-NO），实现可控的光响应NO气体治疗。本研究设计并合成了一系列荧光染料（RBT-NH）。与罗丹明碱结构相比，苯并硫吡啶杂环供体有助于延长吸收/发射波长，达到NIR-II发射区，最大发射波长约为930 nm。此外，引入更能提供电子的正丁胺导致荧光团的光物理性质的明显改善。例如，与RBT-Br相比，RBT3表现出更高的摩尔消光系数和荧光量子产率，导致其更高的亮度，并且RBT3的荧光量子产率（0.106%）大约是RBT-Br（0.063%）的2倍。此外，所有RBT-NH都表现出良好的光稳定性，在连续荧光成像中显示出一种抗猝灭能力。此外，正如预期的那样，一旦RBT-NH的N-H键通过亚硝化转化为N-亚硝基，RBT-NH的吸收峰发生蓝移，荧光猝灭。
体外RBT-NO前药NO的释放
用808nm激光照射前药溶液作为触发，以评估前药的光解封效率（RBT-NO）。RBT3-NO在762 nm的吸收信号降低，在872 nm的吸收信号增加，在933 nm的荧光强度逐渐增加，表明前药RBT3-NO通过光响应分解为相应的荧光染料。由于RBT3-NO具有较高的光敏性，其NO释放效率较好，这是由于其较高的摩尔消光系数。另一方面，RBT3-NO在荧光增强信号中表现出更明显的变化，这表明RBT3-NO可能是更好的NO供体。此外，光解速率也是评价前药RBT-NO的一个重要因素。使用Griess试剂系统监测NO释放，RBT1-NO、RBT2-NO和RBT3-NO的NO产率分别为73.4%、78.5%和81.2%。为了进一步验证前药RBT-NO的可控光解，在黑暗中通过激光交替暴露RBT-NO。在光照条件下观察到明显的荧光信号增强，而在黑暗中荧光强度几乎保持不变，这充分验证了前药RBT-NO的可控光响应特性。
在我们的研究中，设计并合成了血小板膜包裹的纳米颗粒，用于靶向动脉粥样硬化斑块部位和局部NO气体治疗。血小板与动脉粥样硬化斑块的发展密切相关，血小板膜与斑块浸润巨噬细胞的特异性结合以识别早期斑块可能使早期动脉粥样硬化斑块的体内后续指标治疗成为可能。前药RBT3-NO被包裹在胶束的疏水腔中，DSPE-mPEG5k的亲水端均匀分散在团簇表面，大大提高了前药RBT3-NO的水溶性和稳定性。在进一步应用血小板膜涂层后，其尺寸和水合颗粒尺寸增加了约20-25 nm。此外，紫外光谱和荧光光谱证实RBT3-NO-PEG@PM保持了良好的光响应性能。
在成功验证了RBT3-NO-PEG@PM在体外，我们在细胞水平上验证了其细胞内光解活性。使用DAF-FM-DA绿色荧光探针作为NO捕获器来验证RBT3-NO-PEG@PM通过荧光成像。RAW细胞和HUVECs细胞的绿色荧光逐渐增强，表明NO通过RBT3-NO-PEG@PM与DAF-FM-DA反应，验证了纳米颗粒在细胞水平上控制NO光释放的能力。此外，在RBT3-NO-PEG@PM与对照组相比，NO对HUVECs细胞迁移率的促进作用增加了46%，表明NO可以促进内皮细胞的迁移，并在细胞水平上发挥其改善动脉粥样硬化的能力。泡沫细胞的油红O染色结果显示RBT3-NO-PEG@PM光组，进一步支持了上述结果。
活体NO前药的治疗研究
我们在模型小鼠中验证了纳米颗粒的抗动脉粥样硬化活性。RBT3-NO-PEG@PM进入活体小鼠尾静脉，纳米颗粒被靶向并结合在血液循环中的斑块部位，激光照射后荧光呈明显增强趋势，这与体外光谱实验一致。相反，没有血小板膜包封的纳米前药RBT3-NO-PEG不能在斑块区域聚集，并且在激光照射下没有明显的荧光信号。RBT3-NO-PEG@PM激光照射组有明显改善。非治疗组的H&E切片结果显示有血栓形成的迹象，如壁增厚、小空腔和内膜增厚，而治疗组的壁组织排列规则，血栓积聚明显改善。此外，巨噬细胞标志物CD68免疫荧光染色用于证实泡沫细胞的减少和脂质积聚的改善RBT3-NO-PEG@PM激光治疗组。与未治疗组相比，治疗组TNF-α、TGF-β的升高明显减少，预示着炎症的改善。同时，治疗组趋化因子MCP-1和IL-8的表达也显著降低，提示NO治疗促进内皮细胞增殖和迁移，改善炎症环境。
结论
本研究开发了一种仿生血小板NO纳米前药的可激活系统RBT3-NO-PEG@PM用于动脉粥样硬化的诊断和治疗。该纳米前药系统可有效用于通过血小板膜包裹准确定位动脉粥样硬化斑块，并通过808 nm激光照射控制NO的释放。其发射窗口达到NIR-II区域，为深部组织的高分辨率荧光成像开辟了一条有效途径。体内实验结果表明，NO纳米前药系统可以减少动脉粥样硬化斑块中脂质的积累，改善病变中的炎症反应，促进内皮细胞迁移。因此，我们认为我们目前的研究可能为临床动脉粥样硬化的早期诊断和治疗提供一种可行的方法。
参考文献
Near Infrared Light-Activatable Platelet-Mimicking NIR-II NO Nano-Prodrug for Precise Atherosclerosis Theranostics. Yun Chai, Lina Shangguan, Hui Yu, Ye Sun, Xiaoyan Huang, Yanyan Zhu, Hai-Yan Wang, Yi Liu.Adv. Sci. 2023, 2304994,https://doi.org/10.1002/advs.202304994
