内容提要
第二个近红外窗口(NIR-II, 1,000 - 1,700 nm)的光学成像在非侵入性体内检测中具有很大的前景。然而，由于在理想的NIR-IIb (1,500-1,700 nm)“深层组织透明”子窗口中缺乏可用的荧光探针和多路复用技术，实时动态多路复用成像仍然具有挑战性。
本文报道了基于铥的三相降移纳米粒子(α-TmNPs)的1632 nm荧光扩增。这一策略也被用于掺杂NIR-II Er3+ (α-ErNPs)或Ho3+ (α-HoNPs)的纳米颗粒的荧光增强。同时，作者开发了一种具有高时空同步性和精度的双通道同步成像系统。NIR-IIb α-TmNPs和α-ErNPs促进了小鼠皮下组织和缺血性脑卒中模型的血管运动活性和单细胞水平中性粒细胞行为的无创实时动态多路成像。
结果与讨论
新合成的荧光放大NIR-II纳米晶体
作者报道了在核壳纳米结构为NaYF4:Yb0.8/ Tm0.08@NaYbF4@NaYF4 (α-TmNPs)的三相DSNPs中出现的1,632 nm荧光扩增。透射电镜(TEM)显示α-TmNPs为约16 nm的均匀球形。快速傅里叶变换图和x射线衍射测量证实了核壳纳米晶体的立方相。先前报道的铥基纳米颗粒通常处于六方相(β-相)，典型的NIR-II发射波长为1,475 nm。然而，由于水过滤效应(峰值吸收波长在1,450 nm左右)导致的荧光衰减非常大，使得这种发射不适用于NIR-II的体内成像。
在α-TmNPs中，Tm3+从Yb3+中提取激发能，在1632 nm处产生增强荧光，与相同组分(β-TmNPs)的传统六方相1475 nm发光相比，荧光亮度提高了约50倍。相比之下，α-TmNPs的上转换发光明显减弱。α-TmNPs在1632 nm处的量子产率为大约14.0%，比β-TmNPs在1475 nm处的量子产率(0.4%)提高了约35倍。低温吸收光谱证实，1632 nm的值来源于晶体分裂导致的3F4态stark能级居群。1632 nm的发射强度I与激发功率P之间呈非线性关系，I∝P0.58。一个可能的多光子过程可能涉及到填充1632 nm发射，对应于Tm3+的3F4→3H6跃迁。
到目前为止，基于Er的NIR-IIb在1,530 nm发射的DSNPs已经被报道用于深层组织生物成像，但由于与吸水带部分重叠，仍然存在荧光猝灭的问题。α-TmNPs较长的1,632 nm发射点位于吸水曲线的山谷中。因此，与α-ErNPs (α-NaYbF4:Er0.1@NaYbF4@NaYF4)相比，1632 nm发射的有害水过滤效果降低到48%。为了进一步评估1632 nm发射的成像性能，作者捕获了含有α-TmNPs、α-ErNPs或α-HoNPs (α-NaYbF4:Ho0.2@NaYbF4@NaYF4，发射峰在1180 nm)的毛细管，覆盖了不同厚度的1 wt%脂肪内脂。由于α-TmNPs具有较低的吸水率和较长波长的散射效应，因此具有相当高的分辨率和信本比。此外，α-TmNPs和α-ErNPs在NIR-IIb区域的光学性能优于具有较短NIR-II发射的α-HoNPs，这表明它们在NIR-IIb多路成像中具有潜在的应用前景。
光学性质及机理研究
接下来，作者探索了1,632 nm的荧光扩增机制。除了晶体场效应，还观察到多声子辅助的非辐射弛豫(MPR)可以增强Tm3+的3F4居群。α-TmNPs在80-290 K范围内的温度依赖性发光表明，随着温度的升高，3H4(800和1475 nm)和1G4(475和647 nm)的发光强度降低，而3F4态的居群恰恰增强。相反的趋势是，随着温度的升高，非辐射的3H4→3F4通过MPR加速转变。α-TmNPs比β-TmNPs在1475 nm处的荧光衰减剧烈表明，由于α-TmNPs的声子能量(490 cm−1)高于β-TmNPs (350 cm−1)，通过非辐射途径促进了3H4的消耗。
考虑到发射器含量对发光跃迁有重要影响，作者接下来将重点研究Tm3+之间的交叉弛豫过程。1632 nm处的发光持续增强，达到约8 mmol% Tm3+，而475 nm处的发光跃迁随着Tm3+含量的增加而减弱，1475 nm处的发光强度首先增强，并在5 mmol% Tm3+时达到最大值，表明Tm3+ - Tm3+交叉弛缓可以通过3H4 + 3H6→3F4 + 3F4显著促进3F4居群。根据能隙定律，该交叉弛豫过程的能量失配(ΔE = 652 cm−1)在立方相中比在六方相中更有效地被高能声子桥接，这有助于在1,632 nm处进行荧光放大。通过泵浦依赖关系(I∝Pn)验证了上述结果，3H4→3F4非辐射跃迁的增强使得α-TmNPs的n阶值更高。
除了利用MPR辅助的非辐射弛豫外，核心中Yb3+含量的升高通过Yb3+介导的向后-正向能量传递(BFET)进一步增强了1,632 nm的发射。最佳Yb3+ (80 mmol%)除了作为敏化剂吸收980 nm光子并将激发能传递给Tm3+外，还通过反向能量转移(BET)捕获Tm3+ (3H4)的能量，然后通过正向能量转移(FET)填充Tm3+ (3F4)。随着Yb3+含量的增加，3H4 (Tm3+)和2F5/2 (Yb3+)在808 nm激发下(仅被Tm3+吸收)的寿命缩短，以及3F4 (Tm3+)在808 nm激发下的寿命延长，证明了有益的BFET工艺的可行性。475 nm处上转换发光减少也与3H4状态的去激发一致。此外，增加中间层NaYbF4的Yb3+含量和层厚也可以增加3F4种群。
此外，MPR和BFET也被证实可以增强Ho3+和Er3+掺杂纳米颗粒的降移荧光。优化后的α-HoNPs (NaYbF4:Ho0.2@NaYbF4@NaYF4)和α-ErNPs (NaYbF4:Er0.1@NaYbF4@NaYF4)的亮度分别比β相增强了约3.1倍和约1.8倍，表明该策略具有普遍的适用性和可能性。补充表1列出了水溶液α-TmNPs和α-ErNPs对应的量子产率和亮度数据。值得注意的是，虽然晶格畸变、晶体对称性、表面位置占据、表面化学差异和潜在杂质等其他因素也可能影响Tm3+-、Er3+-和Ho3+基纳米晶体的发光强度，但较高的声子能量是NIR-II降移荧光放大的主要因素之一。作者还注意到，尽管在α-相DSNP中实现了NIR-II降移荧光，但其上转换发射仍然弱于先前报道的β-相DSNP。
体外实时动态多路成像
对于实时动态多路复用成像，在时间和空间上同步多个成像通道的信号捕获是必不可少的。为此，作者用两台InGaAs相机构建了双通道NIR-IIb荧光成像系统，该系统可实现最高110帧/秒的动态成像。作者引入了1600 nm长通(LP)二色镜，将光谱上不同的荧光信号分离到两个不同的光束中，以实现同时的双通道荧光成像。在两个通道中各使用截止滤波器以确保高通道单色性。相比之下，传统的基于单个探测器的多路复用方法通过切换滤波器或激发波长顺序采集多个发射信号。作者的方法能够在两个通道中同时采集具有高时空同步性的信号。考虑到InGaAs探测器在1,600.0 nm以上的量子效率衰减，作者制作了更大的α-TmNPs，尺寸为113.9±4.7 nm，发射出更亮的NIR-IIb荧光。随后，制备带有单个(即Tm-， Er-或ho -标记珠)或二元DSNP成分(即Tm/Er标记珠)标记的荧光微球，以评估双通道成像系统的可行性。在高散射小鼠颅骨或皮肤下，两个NIR-IIb通道在Tm通道(记为Tm- ch)和Er通道(记为Er- ch)中显示出相当的空间分辨率和单色性，并且几乎没有变化的头直径，证明了高空间分辨率的深部组织复用成像的可行性。
作者进一步采用玻璃微流体系统来验证成像系统的实时动态多路成像能力。将Tm/ er标记的聚苯乙烯(PS)珠分散在十六烷中，然后以25 ml h-1的流速泵入流道。在20秒内随机跟踪6个珠子的运动。定量结果显示，在Er-Ch和Tm-Ch中，PS珠的平均速度范围分别为66.0 ~ 1180.4 μm min-1和68.0 ~ 1172.3 μm min-1，两个成像通道之间的标准差(sd)较小(小于4%)。为了量化两个成像通道之间的相关性，作者计算了速度和位置的Pearson相关系数(Pr值)。高Pr值的速度(PrV≥0.90)和位置(PrL≥0.96)显示了NIR-IIb动态多路跟踪的高时空同步性和准确性，当灌注率增加到100 ml h-1 (PrV≥0)时，进一步验证了这一点。PrL≥0.99)。
血流动力学的实时多路成像
无创脑血流动力学荧光成像无需移除颅骨以创建颅窗，是准确检测脑血管疾病的理想方法。与短波长的NIR-II区域(1,000-1,400 nm)相比，NIR-IIb子窗口在血管成像方面具有显著优势，特别是对于通过完整颅骨进行脑血管的无创成像， Tm-Ch(11.3-21.3)和Er-Ch(7.7-15.3)的信本比比Ho通道(表示为Ho- ch)(1.1-1.3)高出约7 - 16倍。利用NIR-IIb成像在组织深部的优势，Alexa Fluor 633偶联α- ErNPs (α-Er@Af633)和α- tmnps可以选择性地突出脑动脉和脑血管上的弹性纤维，从而实现对脑动力学的无创实时双通道监测。α-Er@Af633注射后4小时(p.i.)，上矢状窦(SSS)附近的动脉壁清晰描绘，信号在8小时内保持稳定，持续时间超过24小时。TEM图像显示，α-Er@Af633 (~13 nm)沿内皮层外围特异性定位，进一步表明纳米颗粒从血腔外渗并标记在动脉壁上。通过观察麻醉小鼠脑血管运动的动态特征，证实了α-Er@Af633的特异性动脉标记。多路复用成像显示了不同层次的脑血管，包括动脉、静脉和毛细血管，通过弹性纤维标记和血管直径识别。在麻醉小鼠约50s的时间过程中监测脑血管直径的自发变化。时序图结果显示，双色动脉扩张和收缩的峰值幅度(超过10.0%)相对高于小静脉(3.8%)和毛细血管(8.5%)。
作者进一步应用去甲肾上腺素刺激来模拟神经血管耦合效应。在双成像通道中合并两个分离的帧，可以区分双色映射动脉(~16.9 μm)和SSS (~171.0 μm)。静脉注射去甲肾上腺素后，Er-Ch(23.1-46.2%)和dm - ch(24.9-49.7%)的小动脉收缩幅度均大于20%，而在不使用药物时保持稳定。相关分析表明，不同的NIR-IIb通道之间具有高度的时空同步(Pr = 0.95)，可捕获自发性血管收缩。这种行为与先前报道的双光子显微镜通过颅窗对脑血管舒缩刺激的血流动力学反应一致。
单细胞动态的实时多路跟踪
中性粒细胞被认为是急性炎症的第一反应物质。为了评估中性粒细胞的体内实时动态成像，作者将抗ly6G抗体标记的α-TmNPs (α-Tm-aLy6G)注射到皮下耳部炎症小鼠中进行中性粒细胞靶向。同时，注入α-ErNPs水溶液，突出血管。与对照组(3个细胞/分钟)相比，LPS作用5 h时，Tm-Ch(20个细胞/分钟)炎症部位的中性粒细胞募集明显增加(20个细胞/分钟)。在10h时拍摄的实时多路复用图像显示血管中自由流动的中性粒细胞(~4,410 μm min-1)，黄色箭头)，表明它们处于未受刺激和静止状态。此外，定向迁移向单个粘附的中性粒细胞(青色箭头;~138.3 μm min-1)，蜿蜒指数高(>0.8)，表明炎症微环境中的中性粒细胞趋化性。此外，作者观察到中性粒细胞定向爬行，洋红色箭头，运动弱(平均速度为10.8 μm min-1))和中性粒细胞外渗，这与活化中性粒细胞的原型特征一致。定量统计结果显示，爬行中性粒细胞能动性弱(平均速度为12.0 μm min-1)，蜿蜒指数高(>0.8)。
作者进一步对脑卒中小鼠的单细胞免疫反应进行了动态监测。与对照组形成鲜明对比，随着时间的推移，观察到一侧大脑的NIR-IIb信号增加，静脉注射α-Tm-aLy6G后24 h达到最大强度，表明左脑半球受损。这也与偏瘫的行为症状一致。在相同的激发功率密度下，使用体内脑血管成像评估激发激光的热效应，未显示对脑组织的热损伤。
中性粒细胞活化与组织浸润高度相关，组织浸润有助于炎症反应并加重缺血性卒中。为了特异性地追踪活化的中性粒细胞，作者进行了Ly6G和CD11b的双分子靶向，它们通常被用作病理研究中确认活化中性粒细胞(Ly6G+CD11b+)的原型表型的标记。在证明α-Tm-aLy6G-和抗cd11b抗体标记的α-ErNPs (α-Er-aCD11b)具有理想的生物相容性和化学稳定性后，将α-Tm-aLy6G和α-Er-aCD11b给予脑卒中小鼠。将纳米探针从血液循环中清除后，确定了损伤脑中的中性粒细胞分布。通过对切除脑组织中探针的电感耦合等离子体质谱测量，证实了中性粒细胞劫持的纳米探针的特异性炎症靶向性。Tm-Ch和Er-Ch荧光信号的共定位以及电感耦合等离子体质谱测量证实了被中性粒细胞劫持的两种纳米探针的特异性炎症靶向性。放大后的图像显示，Er-Ch(绿色虚线圈)与Tm-Ch(洋红色虚线圈)的荧光区域部分重叠，这可能是中性粒细胞被募集到炎症部位部分激活的原因。
接下来，作者应用双通道实时成像系统通过完整的颅骨研究活化的中性粒细胞。两个成像通道均出现中性粒细胞的NIR-IIb信号，信噪比高达6.12。特别是Er-Ch的强信号表明活化的中性粒细胞表达CD11b整合素。实时图像显示，活化的中性粒细胞运动缓慢，滚动和爬行，跟踪速度为0.82 μm min-1，表明它们在内皮细胞表面粘附牢固。此外，双色图的中性粒细胞似乎沿着血流的剪切力被拉长(细胞1为5.2 μm对6.7 μm，细胞2为6.4 μm对7.6 μm)，这通常被认为是中性粒细胞通过炎症血管外渗的最后一步。
结论
由于在理想的NIR-IIb (1,500 - 1,700 nm)子窗口中缺乏可用的荧光探针和成像技术，深部组织的非侵入性实时动态多路成像仍然是一个持续的挑战。通过调节3H4→3F4非辐射跃迁和BFET工艺，开发出具有1,632 nm发射放大的三相TmNPs，丰富了“最组织透明”NIR-IIb区域的可用DSNPs。考虑到镧系离子丰富的阶梯状能级，基于已建立的机制，预计将发现更多潜在的NIR-II发射带。
DSNP固有的窄发射带，与作者自制的同步双通道NIR-IIb荧光成像系统一起，在Tm和Er通道中实现了时空同步的实时动态多路成像。通过颅骨实时动态多路监测脑血管运动和中性粒细胞动力学，揭示了非侵入性血流动力学和单细胞水平免疫反应研究技术的潜力。虽然已经实现了体内实时动态多路成像，但可以进一步采用NIR-IIb子窗口中更高效的成像探测器(InAs探测器)，纳米探针亮度仍有待提高。有了灵敏的检测器和更亮的DSNPs，体内免疫细胞的非侵入性多路时空分析可能会进一步扩大，以增加细胞类型或标记物的数量，特别是在免疫复杂环境中研究和实现合理的细胞治疗。
参考文献
Fluorescence-amplified nanocrystals in the second near-infrared window for in vivo real-time dynamic multiplexed imaging. Yiwei Yang, Ying Chen, Peng Pei , Yong Fan , Shangfeng Wang , Hongxin Zhang , Dongyuan Zhao , Bin-Zhi Qian & Fan Zhang . Nat. Nanotechnol. https://doi.org/10.1038/s41565-023-01422-2
