内容摘要
荧光探针是单分子成像的重要工具。然而，它们在生物系统中的应用往往受到光漂白、短寿命的限制。为了克服这一问题，作者开发了一种新颖的适用于方酸菁染料的硫化策略。通过对方酸菁的中心四元环丁烯进行硫化（硫方酸），作者观察到单分子水平上的光漂白寿命增加了约5倍。作者的单分子数据分析将这一改善归因于硫化带来的光稳定性的提高。有趣的是，在整体(bulk)环境中的测量显示，在光照下硫方酸会快速氧化为其氧化类似物，导致人们通常认为其光稳定性较差。这种整体和单分子环境之间的性质差异可以归因于后者的特殊环境因素，包括极低的浓度、极大的分子间距和受限的分子运动，这些因素减少了单个分子与其他荧光分子产生的活性氧物种之间的相互作用，最终影响了光漂白和光转换速率。作者展示了硫化方酸菁探针在各种成像缓冲液中的卓越性能，例如葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶（GLOX）和GLOX+trolox等。作者成功地利用这些光稳定的探针进行了膜蛋白CD56的单分子跟踪和活体神经元中线粒体运动的监测。CD56的单分子追踪揭示了不同膜蛋白的运动状态和相应的比例。这项研究有望推动单分子成像探针的发展，特别是在整体测量表现不佳的情况下。
实验结果与讨论
作者首先合成了氧化方酸菁和硫化方酸菁染料，并研究了它们的光物理性质。硫化方酸菁染料具有红移的吸收峰。与氧化方酸菁染料相比，其荧光量子产率只略有降低。这是因为PET淬灭的影响并不显著。
作者在635 nm光照下观察到硫化方酸菁向氧化方酸菁的光转换，导致吸收光谱蓝移和特征峰减小，通过HPLC和MS证实。作者还测量了光转换量子产率。tsq1的光转换量子产率高于tsq2，因为它有更高的单线态氧量子产率。
单分子环境中，作者观察到硫化方酸菁的荧光点比氧化方酸菁消失更缓慢，说明光漂白寿命更长。单分子亮度在硫化后略有下降，但由于光漂白寿命更长，硫化方酸菁染料提供了更多的总收集光子数。
通过建立光转换-光漂白模型，作者分析了硫化方酸菁的光转换行为，并合成了不转换的tsq2-fix，说明了tsq2的光漂白寿命长于sq2的原因。作者还在整体环境中比较了tsq2-fix和sq2的光稳定性，结论与模型一致。
作者随后用tsq2标记膜蛋白CD56进行单分子追踪。tsq2的轨迹长度是sq2的300%，并能够实现对CD56的运动模式、比例、扩散系数和受限半径的探究。
结论
作者通过单原子硫化方法提高了方酸菁的单分子光稳定性。作者全面研究了硫化方酸菁和氧化方酸菁的光学性质，并建立了光转换模型，探究了硫化方酸菁在整体与单分子环境中性质差异的原因。硫化方酸菁在单分子环境中比氧化方酸菁具有更长的光漂白寿命和更多的总收集光子数。作者用tsq2标记了CD56和线粒体，展示了其在活细胞中的单分子成像应用。作者期望这项研究将为单分子成像探针的开发提供重要的启发，特别是对于那些在整体测量中表现不佳的探针。
参考文献
Thiolation for Enhancing Photostability of Fluorophores at the Single-Molecule Level, Jinyang Liu, Bingjie Zhao, Xuebo Zhang, Daoming Guan, Kuangshi Sun, Yunxiang Zhang, Qian Liu, Angew. Chem. Int. Ed. https://doi.org/10.1002/anie.202316192
