内容提要
近红外二区（NIR-II，900−1700 nm）荧光成像因其深层组织穿透性和高对比度而引起了广泛的关注。然而，包含NIR-II波长、高亮度和大斯托克斯位移的小分子荧光团有一个巨大的挑战。在此，我们报道了一系列苯啶基荧光团，命名为YH染料，它们具有高亮度和较大的Stokes位移。在这些染料中，YH-1c具有最好的NIR-II荧光量子产率（在DMSO中为2.06%）和良好的光稳定性。通过尾静脉注射YH-1c NPs获得了惊人的丰富血管细节，即使在5倍放大下，清晰的腹部深层微血管细节。达到10 μm，信号-背景比达到5.21。本研究不仅为高时空分辨率成像提供了一个很有前途的工具，而且为新型NIR-II分子支架的设计提供了有价值的见解。
结果与讨论
在分子设计策略上，合成具有理想光物理性质的苯啶染料也需要实施一种灵活和稳健的合成策略。为了实现苯蓟酮2′位置的功能化，采用了三种不同的取代策略：(1)2′位硝化，其次是钯催化氢化形成氨基，随后与卤代烷烃反应得到(2)2′位，其次是布赫瓦尔德−哈特维格耦合二级胺得到6d−f.48(3)铃木耦合合成6g，随后用甲基亲核试剂处理生成所需的苯蓟酮。合成的最后一步是利用克诺韦纳格尔缩合物构建目标YH染料。通过合理的设计，所有染料的最大发射波长进入近红外II区域。0.易于调节的波长是有机光敏剂的一个显著优点。通过在菲上加入不同的供电子取代基，最高发射波长可以成功调制到79 nm。其中，YH-1b在DCM中的最大吸收波长为987 nm，与YH-1a相比，其红移量增加了79nm。另一方面，由于花菁固有的极性溶剂发色性质，YH染料的吸收波长随着溶剂极性的增加而呈现出明显的蓝移趋势。以YH-1a为例，在DCM中其最大吸收峰在766 nm处，在乙醇中蓝移121 nm，在DMSO中进一步蓝移18nm。这一现象源于YH染料中的电荷分布既没有在整个共轭体系中完全离域形成“类花菁”电子结构，也没有定位于氮原子上形成“类多烯”电子结构。相反，它们表现出两者的结合，因此，在紫外光谱中产生两个相同强度的吸收峰。然而，在高极性溶剂中，“类聚烯”分子的比例增加，而“类聚烯”分子的比例减少，导致紫外光谱中的吸收强度逐渐降低，而属于“类聚烯”花菁的吸收峰占主导地位。尽管存在显著的溶剂效应，但YH染料在高极性溶剂DMSO中仍表现出良好的荧光量子产率，其中YH-1c在DMSO中的荧光量子产率为2.06%。能隙定律指出，非辐射跃迁在低带隙材料中往往占主导地位，因此出现了量子变化。为了进一步研究影响吸收和发射的分子结构和电子分布，我们进行了密度泛函理论（DFT）和TDDFT计算。基态（S0）在B3LYP/6-31+G（d，p）水平上进行了优化；值得注意的是，YH-1系列和YH-2系列染料的优化基态（S0）几何形状均表现出非共面。聚甲基平面（V1）和苯基平面（V2）之间的构象，扭转角约为21°。这种非共面结构影响电子的离域，从而极大地影响发射波长。然而，非共面构象可以降低溶液中聚集诱导的荧光猝灭（ACQ），从而提高荧光量子产率。此外，单点能量计算表明，与喹啉基五甲乙基氰胺相比，YH染料的HOMO能级升高，而所有YH染料的LUMO能级降低，所有染料的HOMO−LUMO能隙均小于1.94 eV，其中YH-1b的最小间隙为1.81 eV，与我们的设计预期一致。随后，通过CAM-B3LYP/6-31+G（d，p）水平上的TD-DFT计算，研究了激发态的电子分布和端基团对激发态的贡献，并使用Multiwfn软件进行了电子空穴分析。53、54相关的电子−空穴分离参数列于表S3。电子−空穴分布表明，YH-1系列染料的第一个垂直激发态是局域激发态（LE），电子转移主要发生在甲基链上。此外，YH-1b显示最长发射波长的原因可以从末端基团的贡献直观地理解。
YH染料较差的水溶性和聚集诱导的猝灭性能显著降低了它们在水溶液中的荧光强度，限制了其在生物成像中的潜在应用。封装脂质体已成为一种很有前途的提高其在水中荧光性能的方法。在这项工作中，我们用DSPE-mPEG2000封装YH-1染料，并评估其在PBS中的荧光性能。透射电镜（TEM）图像显示，YH NPs的平均直径分别为14 nm（YH-1a）、86 nm（YH-1b）和30 nm（YH-1c）。动态光散射（DLS）给出的平均水动力尺寸分别为24 nm（YH-1a）、111 nm（YH-1b）和55 nm（YH-1c）。值得注意的是，由DLS测定的YH NPs的平均尺寸大于TEM的尺寸，这是由于水溶液中颗粒表面周围的水化层。此外，YH-1a、YH-1b和YH-1c在893 nm、948 nm、903 nm处的荧光发射峰分别显著增强。由于YH-1c NPs的高量子产率，适用于深血管成像，以及适当的颗粒大小，可以增加体内循环时间。在确认该染料的亮度适用于血管成像后，将YH-1c NPs静脉注射到小鼠体内进行血管成像。在808 nm激光照射下，使用980 nm的长通滤光片在注射3 min后捕获第一张图像，曝光时间为2 ms。虽然腹部血管的信号-背景比（SBR）仅为1.15，受组织散射的影响，但在此波长下，股骨血管清晰可见。随后，采用1100 nm的长通滤波器，捕获5 min的腹部血管图像。注射后25 s，暴露时间为20 ms。这些图像显示组织散射显著减少，血管清晰度逐渐增强，SBR改善为1.26。在注射后的7 min 49 s和9 min 58 s，分别使用1200和1300 nm的长通滤波器拍摄其他图像。为了验证YH染料在体内血管成像中的优异性能，我们将其成像效果与ICG进行了比较。在尾静脉注射等效剂量的YH-1c和ICG至小鼠5 min后，在808 nm激光照射下，使用1300 nm的长通滤光片，曝光时间为1000 ms，拍摄了两张快照，形成了鲜明的对比。ICG的成像SBR和分辨率均明显低于YH-1c纳米颗粒。由于在光激发下产生单线态氧。这就产生了双重效应：(1)氰基染料中的甲基链共轭键还原性使它们容易受到单线态氧的氧化裂解，导致光漂白，56和(2)这一过程同时导致生物组织内的氧化损伤。相反，在近红外区域II（NIRII）内工作的分子，由于其低能量的三重态，单线态氧的生成减少。这种独特的特性使它们具有更强的光稳定性和生物相容性。在功率密度为1.0W∙cm−2的808 nm激光连续照射下，YH染料表现出比ICG优越的光稳定性，ICG在照射900 s后完全分解。YH染料的光漂白半衰期约为1500s。其中，YH-1c具有最佳的光稳定性，为其在体内成像中的应用奠定了基础。
用NIR-II广角显微镜对小鼠的股血管和下腹血管网进行成像，用1300 nm LP清晰显示血管结构。在腿部和腹部的红线区域的最大SBR值分别为3.33和4.48。即使是小鼠深层直径约为10 μm的小血管，在5倍的放大倍数下也能清晰可见。为了进一步证明YH染料系列的能力，我们口服YH- 1a NPs，1h后清晰观察小鼠肠道蠕动，为消化器官的动态可视化提供了一种无创成像方法。最后，组织学染色显示YH染料具有良好的生物相容性，在主要器官中未观察到细胞死亡或坏死的证据。高空间和时间分辨率的成像能力，结合优良的生物相容性，使YH分子成为一种很有前途的非侵入性生物医学工具。
结论
我们设计并合成了一系列具有可调波长、高亮度、大斯托克斯位移的新型七甲基花菁染料。YH染料的设计加入融合芳香环来扩展共轭体系，形成独特的苯基作为末端杂环。此外，在杂环的2‘位置有不同的供电子取代基，可以精确地调整发射波长。在所有的YH染料中，YH-1c表现出优异的量子产率（在DMSO中为2%）和较大的Stokes位移（>200 nm），使其成为体内成像的最佳候选染料。为了验证我们的设计概念，我们使用YH-1c对小鼠进行血管成像，成功地捕获了全身的详细血管图。通过使用一个1300 nm的长通滤波器，我们证明了减少光散射和改善信号-背景比的成像。与ICG相比，YH-1c在血液循环中表现出异常延长的半衰期，超过了ICG的15倍，进一步强调了YH染料在生物成像中的潜在应用。这项研究扩展了NIR-II小分子荧光团的储备，并为设计和合成具有大斯托克斯位移的高亮度染料提供了新的见解。
参考文献
Tunable Wavelength, High-Brightness, and NIR-II Emission Phenanthridinium-Based Heptamethine Dyes for High-Contrast Vascular and Intestinal Imaging In Vivo, Xiaofan He, Jiaying Yu, Jinzhong Hu, Wanying Wei, Kai Sun, Jian Chen, Zhuoer Cai, Min Liu, Yang Xu, and Baiwang Sun, ACS Materials Lett. 2023, 5, 12, 3192–3202.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsmaterialslett.3c00978.
