内容提要
我们通过将低位阻环丁烷部分整合到二氧杂环丁烷骨架中，构建了超亮余辉纳米系统。在这些环丁烷取代基中，苄基氧代环丁烷二氧杂环丁烷因其最低的位阻成为最亮的余辉分子，与金刚烷二氧杂环丁烷相比，其相对化学激发速率快 35.7 倍，余辉强度高 59 倍，总余辉发射量增加了三个数量级。在相同浓度下，基于苄基氧代环丁烷二氧杂环丁烷的纳米系统产生的单线态氧几乎是游离维替泊芬的五倍。在 CNV 小鼠模型中，使用我们的纳米系统进行循环治疗可使病变面积减少 64.9%，优于游离维替泊芬 39.3% 的减少率。
超亮余辉底物的合成与性质表征
我们合成了一系列二氧杂环丁烷，包括丙烯酸甲酯 - 苯氧基 - 金刚烷（MPA，金刚烷二氧杂环丁烷）、丙烯酸甲酯 - 苯氧基 - 环丁酮（MPC，环丁烷二氧杂环丁烷）、丙烯酸甲酯 - 苯氧基 - 苯基环丁烷（MPP，苯基环丁烷二氧杂环丁烷）和丙烯酸甲酯 - 苯氧基 - 苄基氧代环丁烷（MPCO，苄基氧代环丁烷二氧杂环丁烷）。核磁共振（NMR）和液相色谱 - 质谱（LC-MS）证实了所有化合物的结构。每种底物与 O₂氧化形成瞬态二氧杂环丁烷中间体。在此过程中，来自苯氧化物部分的电子转移诱导分解，释放能量使中间体激发，随后发射余辉。本研究中使用的合成路线采用温和条件和廉价试剂，以获得高产率产物（如 MPCO 的产率为 88%），支持其在转化背景下大规模生产的可行性。在水溶液中评估了四种余辉底物的光学特性。尽管空间位阻基团不同，但其吸收和荧光光谱具有可比性，峰值吸收和荧光波长分别为 400 nm 和 540 nm。暴露于 O₂（通过 NaClO 和 H₂O₂生成）后，所有底物均在 540 nm 处表现出余辉，但其余辉强度和动力学差异显著。其中，MPCO 表现出最高的余辉强度，分别超过 MPP 1.88 倍、MPC 2.83 倍和 MPA 14.9 倍。MPA、MPC、MPP 和 MPCO 的半衰期分别为 1250 s、95 s、50 s 和 35 s。根据半衰期计算，MPCO 的相对化学激发速率是 MPA 的 35.7 倍（表 S1）。此外，MPA、MPC、MPP 和 MPCO 的总余辉发射（TAE）值分别为 0.1、91.5、80.5 和 106.2 余辉・秒。其中 MPCO 的 TAE 约为 MPA 的 1060 倍（P < 0.0001）。MPCO 与 MPA 在 TAE 上的近 1000 倍差异，与先前报道中受控条件下取代化学发光底物总光输出变化可忽略的情况形成对比。这种差异可归因于我们系统中余辉底物的 O₂触发氧化效率不同，影响高能中间体的生成速率和产率，而非其固有发光特性。与动力学分析一致，余辉成像证实 MPCO 在四种底物中表现出最高的余辉效率，瞬时余辉强度达到 17.7×10⁹ p/s/cm²/sr/μM，是 MPA（0.3×10⁹ p/s/cm²/sr/μM）的 59 倍。电子自旋共振（ESR）光谱显示，与 MPA 相比，MPCO 在相同条件下产生更多的自由基中间体信号。
余辉纳米系统的制备与表征
在确认 MPCO 优异的余辉性能后，我们着手设计用于 CNV 循环治疗的超亮余辉纳米系统。该纳米系统由三个关键组件组成：MPCO（超亮余辉底物）、作为能量转移媒介的荧光分子，以及临床批准用于治疗 CNV 的光敏剂维替泊芬（Ver）。为提高能量转移效率，我们测试了多种荧光团：供体 - 受体 - 供体荧光团（BTD540）、荧光素（Fluo）和半菁（CyOH）。通过 NMR 和 LC-MS 对 BTD540 和 CyOH 进行了合成与结构确认。我们基于这些荧光团与 MPCO 余辉发射及 Ver 吸收的光谱匹配性进行筛选。BTD540 表现出较大的斯托克斯位移，并且与 MPCO 和 Ver 均具有最佳的光谱重叠。这种重叠显著提高了能量转移效率，MPCO-BTD540-Ver 纳米粒的余辉强度明显优于 MPCO-Fluo-Ver 和 MPCO-CyOH-Ver 配方。前沿轨道的计算分析显示，BTD540（2.13 eV）和 Ver（2.08 eV）的 HOMO-LUMO 能隙逐渐减小，证实了能量转移的高效性。我们选择 BTD540 作为纳米系统中的最佳荧光团。用于循环光动力治疗的超亮余辉纳米系统（APDT@cRGD NPs）以 1,2 - 二硬脂酰 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸乙醇胺 - 聚乙二醇 - 环（精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸 - D - 苯丙氨酸 - 赖氨酸）（DSPE-PEG-cRGD）作为两亲性稳定剂，通过共沉淀法将 MPCO、BTD540 和 Ver 整合其中。此外，靶向配体 cRGD 对整合素 αvβ3 具有高选择性，该受体在 CNV 相关的内皮细胞上过度表达。动态光散射（DLS）显示 APDT@cRGD NPs 的流体力学直径为 90±30 nm，透射电子显微镜（TEM）证实其呈球形形态。APDT@cRGD NPs 在 400 nm、540 nm 和 680 nm 处的吸收峰分别对应 MPCO、BTD540 和 Ver，与其在 540 nm、680 nm 和 700 nm 处的发射光谱良好匹配。在纳米粒的余辉光谱中，清晰观察到约 700 nm 处的特征峰，对应 Ver 的发射，表明纳米系统内发生了高效的能量转移。进一步优化确定 MPCO、BTD540 和 Ver 的质量比为 1:2:1 为理想配比，辐照参数为 200 mW/cm² 持续 30 秒。该配置在 BTD540/Ver 质量比为 2:1 时实现了 87.16% 的荧光共振能量转移（FRET）效率，且 BTD540 与 Ver 之间的福斯特距离（R₀）计算为 1.82 nm。经过五次激光辐照（200 mW/cm²，每次 30 秒）后，余辉强度下降约 50%，显示出重复激活下的稳定性能。
余辉纳米系统用于循环光动力治疗的机制
在 CNV 治疗中，维替泊芬（Ver）的应用受到其显著疏水性和有限化学稳定性的阻碍。此外，长时间激光照射常导致邻近眼组织的附带损伤。为克服这些限制，我们开发了 APDT@cRGD NPs。靶向配体 cRGD 使 APDT@cRGD NPs 在静脉注射后能够精准定位到 CNV 病变部位。通过促进余辉发光，该系统实现了原位循环治疗，疗效得以增强。循环治疗机制始于 Ver 在 690 nm 激光照射下通过光动力过程激活，生成 ¹O₂。这种激活不仅触发 PDT，还氧化 MPCO。MPCO 的氧化形成反应性环丁烯中间体，该中间体通过加速的化学激发过程释放能量。释放的能量通过余辉共振能量转移（ARET）依次转移至 BTD540，随后通过荧光共振能量转移（FRET）转移至 Ver。这种持续的能量接力重新激活 Ver，使其能够重复生成 O₂并维持循环光动力治疗。为证实 APDT@cRGD NPs 中超亮余辉用于循环光动力治疗的机制，我们合成了仅包含 MPCO 和 Ver 的对照纳米粒（MPCO-Ver NPs）。随着 BTD540 的加入，APDT@cRGD NPs（1 mg/mL）在 700 nm 处的余辉强度比 MPCO-Ver NPs（1 mg/mL）增加了约 1.65 倍。在 MPCO-Ver NPs 中，700 nm 处的余辉源于 MPCO 的发射光谱与 Ver 的吸收光谱的部分重叠。余辉成像显示，APDT@cRGD NPs（1 mg/mL）的余辉保留时间比 MPCO-Ver NPs（1 mg/mL）长四倍以上。定量分析表明，尽管 MPCO-Ver NPs 在 15 分钟后表现出 2.0×10⁶ p/s/cm²/sr 的余辉强度，但 APDT@cRGD NPs 即使在 1 小时后仍保持 6.5×10⁶ p/s/cm²/sr 的强度。这种持久的余辉归因于 MPCO、BTD540 和 Ver 之间的协同能量转移相互作用，其中被 BTD540 和 MPCO 激发的 Ver 持续产生 ¹O₂。这种 O₂重新激活剩余的 MPCO，维持余辉并放大 PDT 循环。为验证 APDT@cRGD NPs 的 O₂生成，我们使用了 DCFH 荧光探针（50 μM），该探针是活性氧物种的敏感指示剂。激光照射后，APDT@cRGD NPs（1 mg/mL）产生的 O₂水平比 MPCO-Ver NPs（1 mg/mL）高 1.38 倍。
余辉纳米系统的体外靶向与治疗效果
靶向配体 cRGD 对整合素 αvβ3 表现出高选择性，该受体在内皮细胞上过度表达且与 CNV 的发展密切相关。通过使用 DSPE-PEG-2000 经共沉淀法包封 MPCO、BTD540 和 Ver，构建了不含 cRGD 的对照纳米粒（APDT NPs）。与 APDT@cRGD NPs 相比，APDT NPs 表现出更正的 zeta 电位（−1.04 mV vs −2.54 mV）。MTT 测定证实 APDT@cRGD NPs 在 ARPE-19 和 HUVECs 细胞中具有生物相容性，在 200 μg/mL 浓度下未观察到细胞毒性。同时，在短期低功率激光条件（690 nm，2.5 J/cm²，10 mW，250 s）下，未检测到细胞毒性。因此，后续细胞实验在适当浓度（200 μg/mL）和激光条件（690 nm，2.5 J/cm²，10 mW，250 s）下进行，且未对细胞造成损伤。靶向研究表明存在整合素 αvβ3 特异性结合，HUVECs 细胞中 APDT@cRGD NPs 的荧光（[NPs]=200 μg/mL，[cRGD]=1 μM）比等效 APDT NPs（200 μg/mL）高 1.93 倍（P<0.0001），且可被游离等效 cRGD 肽（1 μM）竞争性抑制（P<0.0001）。为评估 HUVECs 细胞中的光动力效应，我们利用 DCFH-DA 来测量不同处理组中 ¹O₂的产生。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示，在 690 nm 激光照射下，APDT@cRGD NPs 产生的 O₂水平是 Ver 的 2.29 倍（P<0.0001）。此外，我们使用 IVIS 体内成像系统捕获了各组的余辉信号。由于 cRGD 的靶向能力，APDT@cRGD NPs 在 HUVECs 细胞中的余辉信号强度是 APDT NPs 的 3.4 倍。相比之下，Ver 组未显示余辉信号，因为其缺乏 MPCO 余辉底物。
余辉纳米系统的体内靶向与治疗效果
我们向 CNV 小鼠模型（C57BL/6 小鼠，6-8 周龄）静脉注射 1 mg/kg APDT@cRGD NPs（200 μg/mL），以评估其视网膜靶向效率。CNV 通过激光光凝诱导，导致 Bruch 膜破裂。与正常眼底相比，CNV 受累眼底表现出特征性的斑片状血管渗漏模式。首先，我们研究了静脉注射后不同时间点（12、24 和 48 小时）APDT@cRGD NPs 的体内分布。注射后 CNV 小鼠主要器官的离体荧光成像显示，24 小时时眼部荧光强度增强，比 12 小时时高 1.41 倍（P=0.0218）。同时，肝脏中的荧光信号随时间减弱，表明 APDT@cRGD NPs 可通过肝脏代谢。为分析视网膜分布，我们在不同时间点（12、24 和 48 小时）注射 APDT@cRGD NPs（200 μg/mL），并使用 CLSM 检查视网膜切片。结果表明，注射后 24 小时是纳米颗粒积累的最佳时间点，视网膜荧光强度比 12 小时时高 1.57 倍（P=0.0367）。注射后 24 小时，APDT@cRGD NPs 的平均荧光强度（MFI）约为非靶向 APDT NPs 的 2.2 倍（P=0.0080），表明视网膜靶向性得到改善。APDT@cRGD NPs 眼内分布的定量分析显示，其荧光信号主要定位在脉络膜，在视网膜中积累极少，这突出了纳米颗粒的靶向特异性。为进一步评估靶向能力，我们采用血管标记物异凝集素 B4 - 荧光素 5 - 异硫氰酸酯（IB4-FITC）染色，检测 RPE - 脉络膜复合体中 CNV 病变部位的纳米颗粒定位。在注射 APDT NPs 和 APDT@cRGD NPs 后 24 小时制备 RPE - 脉络膜复合体，并检查 CNV 病变与纳米颗粒的重叠情况。结果表明，APDT@cRGD NPs 与 CNV 病变的重叠率高于 APDT NPs，这可能归因于 RGD 修饰，其特异性靶向新生血管内皮细胞上高度表达的整合素 αvβ3 受体。定量分析进一步显示，APDT@cRGD NPs 组脉络膜切片中的红色荧光强度约为 APDT NPs 组的 3.43 倍（P=0.0009）。基于 APDT@cRGD NPs 的靶向能力，我们进一步评估了其在激光诱导 CNV 小鼠中的治疗潜力。激光诱导的 CNV 模型代表了急性创伤诱导的血管生成反应，而 AMD 则涉及慢性炎症和退化。尽管如此，这两种模型都以异常血管生成为核心病理特征。我们选择该模型是因为其具有可重复性、可量化性，且在临床前治疗评估中应用广泛。激光诱导后 7 天，使用眼底荧光血管造影（FFA）和光学相干断层扫描（OCT）确认病变部位的病理性血管渗漏。FFA 显示高荧光渗漏区域，而 OCT 显示局部增厚，这是 CNV 进展的标志性特征。将小鼠（C57BL/6 小鼠，6-8 周龄）分为六个治疗组：空白组、PBS（200 μL）+ 激光（690 nm，25 J/cm²，80 mW，315 s）、Ver（1 mg/kg，200 μg/mL）+ 激光（690 nm，25 J/cm²，80 mW，315 s）、APDT NPs（1 mg/kg，200 μg/mL）+ 激光（690 nm，25 J/cm²，80 mW，315 s）、APDT@cRGD NPs（1 mg/kg，200 μg/mL）和 APDT@cRGD NPs（1 mg/kg，200 μg/mL）+ 激光（690 nm，25 J/cm²，80 mW，315 s）。所有注射药物的浓度为 200 μg/mL，注射剂量为 1 mg/kg。对于需要 PDT 的组，在 CNV 诱导后第 8 天应用 690 nm 激光（25 J/cm²，80 mW，315 s）。根据上述靶向实验，纳米系统组在注射后 24 小时进行激光照射。Ver 组在注射后 2 小时进行激光照射，这与作为小分子药物的 Ver 快速代谢清除的特点一致。到第 14 天，FFA 显示 APDT@cRGD NPs（激光）组的 CNV 面积与所有其他组相比显著减少。APDT@cRGD NPs（激光）组的相对 CNV 面积达到 64.9%，明显超过 Ver（激光）组 39.3% 的减少率（P=0.0025）。与此一致，OCT 成像显示 APDT@cRGD NPs（激光）组的病变厚度减少了 72.1%，优于其他治疗组。苏木精和伊红（H&E）染色显示，APDT@cRGD NPs 治疗的小鼠水肿明显减轻，突显了该治疗方案的有效性（P=0.0002）。由于 CNV 是进行性视力丧失的主要原因，我们采用视网膜电图（ERG）分析来测量 CNV 小鼠的视觉功能恢复情况。在暗适应条件和 2.7 cd・s/m² 闪光刺激下，APDT@cRGD NPs（激光）治疗的小鼠表现出显著增强的 A 波（P<0.0001）和 B 波（P<0.0001）振幅，表明光感受器活性得以恢复。为了进一步阐明光疗机制，我们使用免疫荧光染色分析炎症和血管生成标志物。治疗后测量促炎细胞因子 IL-1β 和血管生成因子 VEGF。与其他组相比，APDT@cRGD NPs（激光）组的 IL-1β（P=0.0004）和 VEGF（P=0.0003）表达显著降低，表明其具有强大的抗炎和抗血管生成作用。这些结果确立了 APDT@cRGD NPs 在 CNV 循环光动力治疗中的优越疗效。我们还发现，APDT@cRGD NPs（激光）的余辉强度高于 APDT NPs（激光），这归因于 cRGD 介导的在视网膜和 CNV 病变中的保留（P<0.0001）。
总结
通过引入低位阻苄基氧代环丁烷部分，我们合成了超亮余辉分子 MPCO。与基于金刚烷的二氧杂环丁烷 MPA 相比，MPCO 表现出显著更高的余辉强度、加速的化学激发作用，且总余辉发射量（TAE）增加了三个数量级。基于这些发现，我们设计了 APDT@cRGD 纳米系统，其由 MPCO、BTD540、维替泊芬（Ver）和 DSPE-PEG-cRGD 组成，用于脉络膜新生血管（CNV）的循环治疗。该系统利用其强烈的余辉和高效的能量转移，在含相同剂量 Ver 的情况下，产生的单线态氧是游离 Ver 的 4.6 倍。在 CNV 小鼠模型中，使用 APDT@cRGD 纳米粒进行循环治疗可使病变面积减少 64.9%，优于游离等效 Ver 所实现的 39.3% 的减少率。
参考文献
Sterically Controlled Cyclobutane-Dioxetane Ultrabright Afterglow Nanosystem for Cyclic Therapy of Choroidal Neovascularization in Mice ,Jiawei Zhang, Haoliang Shi, Xuan Qin, Pengcheng Wang, Yufan Ling, Xiangbowen Jin, Mingyue Cui,Bin Song,* Houyu Wang,* and Yao He*,J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 19315−19328,https://doi.org/10.1021/jacs.5c05187
