内容提要
本研究提出一种多功能级联纳米反应器，整合了近红外二区（NIR-II）I 型光动力疗法、光热疗法和气体疗法，以增强肿瘤消融效果。该平台基于一种聚集诱导发光AIEgen—TBT-PyT，在808 nm 激光照射下，它能够高效生成超氧阴离子（O₂⁻），并具有较强的光热转换能力。同时，该平台共负载了一种热敏感性一氧化氮（NO）供体 ——S - 亚硝基 - N - 乙酰青霉胺，以实现 NO 的可控释放。O₂⁻与 NO 原位反应生成过氧亚硝酸盐（ONOO⁻），从而放大氧化应激、降解细胞外基质并改善治疗穿透性。
AIEgens 的设计和光物理性质
我们首先构建了 D-π-A-π-D 分子框架，以 6-（2 - 乙基己基）[1,2,5] 噻二唑并 [3,4-f] 苯并三唑（TBT）作为电子接受核心，甲氧基取代的三苯胺（TPA）作为电子给体单元。为调节电子和光学特性，我们引入了三种不同的芳香族 π 桥，分别是苯（TBT-PhT）、噻吩（TBT-ThT）和吡咯（TBT-PyT），它们的富电子性依次增强。我们策略性地引入甲基取代基，以诱导扭曲的分子几何结构，这是减少分子间相互作用和促进 AIE 特性的关键特征。为研究这三种分子的光物理性质，我们在甲苯溶液中记录了它们的吸收光谱和发射光谱。TBT-PhT 的吸收峰蓝移最显著，位于 517 nm。TBT-ThT 的吸收峰明显红移，移至 628 nm。TBT-PyT 的吸收红移最大，峰值位于 687 nm。吸收和发射的红移趋势可归因于 π 桥的给电子特性，尤其是吡咯环。因此，TBT-PhT、TBT-ThT 和 TBT-PyT 的最大发射波长分别位于 604、844 和 965 nm。为评估它们的 AIE 特性，我们在不同水比例的四氢呋喃/水混合溶液中测量了这三种分子的光致发光强度。在水含量低于 50% 的溶液中，光致发光强度逐渐降低，这可归因于扭曲分子内电荷转移（TICT）效应导致的荧光淬灭。然而，当水比例超过 50% 时，光致发光强度显著增加，表现出明显的 AIE 效应的荧光增强特征。
级联纳米反应器的制备与表征
为提高生物相容性和肿瘤靶向能力，通过两亲性聚合物 DSPE-PEG2000-FA 对三种 AIEgens 进行包裹，制备出纳米颗粒（NPs）。这些纳米颗粒的最大吸收峰呈现逐步红移趋势，从 TBT-PhT NPs 的 526 nm 移至 TBT-ThT NPs 的 642 nm，再进一步移至 TBT-PyT NPs 的 692 nm。与甲苯中的单体形式相比，纳米颗粒吸收光谱的显著红移主要归因于聚集的纳米颗粒核心内增强的分子间 π-π 堆积作用。值得注意的是，TBT-PyT NPs 在 800-1000 nm 波长范围内有强吸收，可在 808 nm 激光下有效激发，这得益于其优越的组织穿透能力。TBT-PhT NPs、TBT-ThT NPs 和 TBT-PyT NPs 的最大发射峰分别位于 719、862 和 966 nm。更重要的是，TBT-PyT NPs 表现出强烈的近红外二区（NIR-II）发射，波长超过 1000 nm，使其在高分辨率近红外二区生物成像应用中极具潜力。为进一步评估其近红外二区发射效率，用 808 nm 激光照射纳米颗粒溶液（100 μg/mL），并收集 1000 nm 以上的发光。TBT-PhT NPs 和 TBT-ThT NPs 的平均荧光强度（MFI）相对 TBT-PyT NPs 较弱，这主要是由于它们在激发波长处的吸收率较低。在 808 nm 激光照射（0.8 W/cm²）下，TBT-PyT NPs 表现出最高的光热性能，在 600 s 内温度升高 21.9°C。相比之下，TBT-PhT NPs 和 TBT-ThT NPs 的温度升高显著较低，分别为 4.9°C 和 4.1°C（。为评估总活性氧（ROS）生成，在 808 nm 激光照射下使用 2'，7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为指示剂。在三种纳米颗粒中，TBT-PyT NPs 表现出最高的活性氧生成量，照射 5 分钟后荧光强度增加 57 倍。为进一步研究特定的活性氧种类，使用 9,10 - 蒽二基双（亚甲基）- 二丙二酸（ABDA）、二氢罗丹明 123（DHR123）和羟苯基荧光素（HPF）进行了额外分析。结果显示，所有纳米颗粒均不生成单线态氧（¹O₂），这可由 ABDA 的吸收无显著变化证实。然而，TBT-ThT NPs 和 TBT-PyT NPs 均表现出强烈的 I 型活性氧生成，分别通过 DHR123 和 HPF 测定中的显著荧光增强证实其产生了超氧阴离子（O₂⁻）和羟基自由基（・OH）。总体而言，具有优异 O₂⁻和・OH 生成能力的 TBT-PyT NPs 在 I 型光动力疗法中显示出巨大潜力。这一特性为与一氧化氮（NO）的联合治疗提供了良好基础，二者可形成具有高细胞毒性的过氧亚硝酸盐（ONOO⁻），进一步增强治疗效果。S - 亚硝基 - N - 乙酰青霉胺（SNAP）在受热时具有随温度变化释放一氧化氮的能力。当将其掺入 TBT-PyT NPs 中时，推测混合的 TBT-PyT/S NPs 可触发级联反应。具体而言，在近红外光照射下，TBT-PyT 预计会产生热量，诱导 SNAP 释放一氧化氮。释放的一氧化氮随后会与生成的超氧阴离子反应形成过氧亚硝酸盐。采用与 TBT-PyT NPs 相同的制备方法合成了 SNAP NPs 和 TBT-PyT/S NPs。动态光散射（DLS）分析显示 SNAP NPs、TBT-PyT NPs 和 TBT-PyT/S NPs 的粒径分别为 177、65 和 73 nm。研究人员对 TBT-PyT/S NPs 的功能进行了评估，重点考察了其光热行为、一氧化氮（NO）释放能力以及过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）的生成情况。研究表明，通过改变浓度和激光功率密度，TBT-PyT/S NPs 的光热性能是可调节的。具体而言，在 808 nm 激光（0.8 W/cm²）照射下，20 μg/mL 的 TBT-PyT/S NPs 溶液在 5 分钟内将温度从 30.3 °C 升至 49.7 °C，并且在 6 个照射循环中保持了稳定的性能。SNAP 在 300-450 nm 范围内有吸收，最大吸收峰位于 340 nm。加热时，SNAP 会发生热分解，导致其在 340 nm 处的吸光度逐渐下降。然而，SNAP 的吸收光谱与 TBT-PyT 分子的吸收光谱存在重叠，这使得仅根据混合的 TBT-PyT/S NPs 在 340 nm 处的变化来监测 SNAP 的分解并不可靠。
因此，为了准确评估 NO 的释放，研究中单独使用了 SNAP 或 SNAP NPs，而非与 TBT-PyT/S NPs 联合使用。为了研究 SNAP 的热分解行为，在不同温度下监测了 340 nm 处的吸光度随时间的变化。孵育 4 小时后，SNAP 在 25 °C 和 37 °C 下分别保留了初始吸光度的 94.9% 和 81.1%。稳定性研究进一步证实，在 37 °C 下，SNAP 在 PBS 和 RPMI 1640 培养基中的热分解行为与在水中相似，这支持了其在生理条件下的可靠响应性。相比之下，在 50 °C 时，吸光度降至 54.7%，表明升高温度会显著加速 SNAP 的分解及相应的 NO 释放。使用商用 NO 检测试剂盒对 SNAP 和 SNAP NPs 释放的 NO 进行了进一步定量。200 μg/mL 的 SNAP 溶液孵育 4 小时后，NO 浓度从 4 °C 时的 1.25 μg/mL 增加到 50 °C 时的 2.88 μg/mL。类似地，SNAP NPs 组的 NO 浓度从 4 °C 时的 0.237 μg/mL 增加到 50 °C 时的 0.595 μg/mL。这些结果表明，TBT-PyT 的光热效应可有效触发 SNAP 分子的温度响应性 NO 释放。最后，使用 BBoxiProbe O58 检测试剂盒评估了 TBT-PyT/S NPs 在体外生成 ONOO⁻的情况。SNAP NPs 在 808 nm 激光（0.5 W/cm²）照射 5 分钟后，荧光强度无明显变化，表明其产生的 ONOO⁻极少。相比之下，TBT-PyT/S NPs 的荧光显著增强，增加了 5.4 倍，证实其可高效生成 ONOO⁻。
体外抗肿瘤活性
进一步在细胞水平上评估了 TBT-PyT/S NPs 的潜在治疗效果。首先，对细胞摄取情况进行了评估。与 TBT-PyT/S NPs 孵育 4 小时后，观察到的细胞内吞量有限。然而，孵育 6 小时后出现了显著的摄取，这为后续实验中孵育时间的选择提供了依据。接下来，在 4T1 细胞中检测了 SNAP NPs、TBT-PyT NPs 和 TBT-PyT/S NPs 的细胞毒性。将细胞与相应的纳米颗粒孵育，用 808 nm 激光照射 10 分钟，然后继续孵育 16 小时。随后使用 MTT 法评估细胞活力。SNAP NPs 未表现出可检测的细胞毒性，在所有测试浓度下，无论是否接受激光照射，细胞活力均保持在 94% 以上。TBT-PyT NPs 也表现出良好的生物相容性，在 80 μg/mL 浓度且无照射的情况下，细胞活力为 86.3%。然而，在激光照射下，80 μg/mL 浓度时细胞活力急剧下降至接近 0%，20 μg/mL 浓度时降至 63.0%，表明其具有浓度依赖性和可控的光毒性作用。同样，TBT-PyT/S NPs 在无光照情况下表现出极低的细胞毒性，尤其是在浓度低于 40 μg/mL 时。在激光照射下，20 μg/mL 的 TBT-PyT/S NPs 表现出与 TBT-PyT NPs 相当的光毒性，使细胞活力降至 57.4%。这些发现表明，光毒性主要由 TBT-PyT 光敏剂驱动。重要的是，TBT-PyT/S NPs 比单独的 TBT-PyT NPs 表现出更强的肿瘤细胞杀伤效果，这表明产生了具有高细胞毒性的过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）。活 / 死染色图像进一步证实了这些结果，显示在 808 nm 激光照射下，经 TBT-PyT/S NPs 处理后的细胞中出现大量红色染色（死亡）细胞，证实了其强大的细胞杀伤作用。
接下来，检测了细胞内活性氧（ROS）的产生和一氧化氮（NO）的释放行为。使用 DCFH-DA 检测细胞内的活性氧水平。无论是否接受光照，SNAP NPs 组和 PBS 对照组均未产生可检测的活性氧荧光信号。相比之下，TBT-PyT NPs 和 TBT-PyT/S NPs 在 808 nm 激光照射下发出强烈的绿色荧光信号，而在黑暗中则无荧光。定量荧光强度分析显示，TBT-PyT NPs 和 TBT-PyT/S NPs 的信号强度分别为 20.8 和 28.9 a.u.，表明 TBT-PyT/S NPs 的活性氧生成能力源于 TBT-PyT 分子。在 TBT-PyT/S NPs 组中观察到的 DCFH-DA 荧光增强反映了总氧化应激的加剧，这是由于超氧阴离子（O₂⁻）、过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）和其他活性氧的共同存在，其中通过特异性荧光探针证实的过氧亚硝酸盐形成表明存在一种协同作用机制驱动治疗效果。为了评估一氧化氮的释放，使用了细胞内一氧化氮探针 4 - 氨基 - 5 - 甲基氨基 - 2'，7'- 二氟荧光素二乙酸酯（DAF-FM DA）。在照射下，TBT-PyT/S NPs 中的 SNAP 分解导致一氧化氮释放，在 4T1 细胞中产生明亮的绿色荧光。统计荧光分析表明，在黑暗条件下，TBT-PyT/S NPs 可逐渐释放一氧化氮，而激光照射显著加速了这一过程。为了进一步验证过氧亚硝酸盐和活性氮物种（RNS）的生成，使用了 BBoxiProbe O58（过氧亚硝酸盐检测试剂盒）和 BBoxiProbe O53（活性氮物种检测试剂盒）。未经激光照射的 TBT-PyT/S NPs 处理的 4T1 细胞与对照组相似，产生的过氧亚硝酸盐和活性氮物种可忽略不计。相比之下，仅在 808 nm 激光照射下的 TBT-PyT/S NPs 组中观察到显著的红色荧光。定量分析证实，TBT-PyT/S NPs 在激光照射下会生成大量的过氧亚硝酸盐和活性氮物种。
原位乳腺癌的体内实验
采用皮下肿瘤模型研究 TBT-PyT/S NPs 在肿瘤部位的聚集情况。尾静脉注射后，肿瘤部位的近红外二区荧光强度逐渐增强，在 36 小时达到峰值，甚至在 72 小时仍保持较高水平。因此，在后续治疗中，于注射后 36 小时进行 808 nm 激光照射。TBT-PyT/S NPs 在肿瘤部位的有效聚集归因于增强的渗透和滞留（EPR）效应以及叶酸受体识别介导的主动靶向作用，这得益于纳米颗粒表面的叶酸功能化修饰。为进一步验证其在体内的光热效应，在裸鼠中建立了原位乳腺癌模型。在 808 nm 激光（0.6 W/cm²）照射下，TBT-PyT/S NPs 处理组的肿瘤在 10 分钟内达到 50.5 °C，这一温度适合温和的光热治疗。接下来评估了 TBT-PyT/S NPs 的体内治疗效果。建立原位肿瘤模型后，在第 0、4 和 8 天静脉注射纳米颗粒，并在第 1、5 和 9 天施加 808 nm（0.6 W/cm²）激光照射。在 14 天的治疗期间监测肿瘤体积和小鼠体重。研究结束时，处死小鼠并收集肿瘤进行组织学分析。TBT-PyT/S NPs + 激光组的肿瘤明显缩小，部分肿瘤完全消失。这一观察结果与肿瘤体积测量结果一致，该组的肿瘤生长在首次治疗后显著减缓。在第 7 至 11 天期间，肿瘤大小持续减小，到第 14 天最终仅为初始体积的 30%。相比之下，未接受激光照射的 TBT-PyT/S NPs 组未显示治疗效果，其肿瘤体积与 PBS 组、PBS + 激光组、SNAP NPs 组、SNAP NPs + 激光组和 TBT-PyT NPs 组相当，均超过初始体积的 4.7 倍。TBT-PyT NPs + 激光组显示出中等程度的肿瘤生长抑制作用，这可能归因于 TBT-PyT 的光热和光动力效应。然而，其治疗效果不如 TBT-PyT/S NPs + 激光组，尤其是在治疗后期。这种增强的疗效可能是由于 SNAP 的存在，它在肿瘤部位提供持续的一氧化氮释放，促进过氧亚硝酸盐的原位生成，从而对肿瘤细胞和肿瘤微环境造成更大的损伤。肿瘤重量分析进一步证实了 TBT-PyT/S NPs + 激光组的优异治疗性能，该组在所有组中表现出最低的肿瘤重量。
结论
我们开发了一种多功能级联纳米反应器平台，该平台整合了近红外二区（NIR-II）I 型光动力疗法、光热疗法和一氧化氮气体疗法，以增强癌症治疗效果。该系统以一种新设计的具有聚集诱导发光特性的光敏剂 TBT-PyT 为核心，在 808 nm 激光照射下，该光敏剂表现出强烈的近红外二区荧光、高效的 I 型活性氧生成能力和强大的光热转换性能。吡咯因其强给电子能力、最小的空间位阻以及促进高效分子内电荷转移和 I 型活性氧生成的能力而被选作 π 桥，这使其有别于噻吩和苯等其他候选物。通过共载 S - 亚硝基 - N - 乙酰青霉胺（SNAP）作为热响应性一氧化氮供体，TBT-PyT/S NPs 纳米平台能够通过超氧阴离子与一氧化氮的反应，实现高细胞毒性过氧亚硝酸盐的时空可控原位生成。大量的体外和体内评估表明，这种级联纳米反应器不仅能诱导强效的肿瘤细胞凋亡和细胞外基质降解，还能显著增强药物穿透能力并抑制肿瘤生长。
参考文献
Cascade Nanoreactors for In-Situ Peroxynitrite Generation via Pyrrole-Bridged NIR-II Type I Photosensitizers to Enhance Tumor Phototherapy，Peikun Xin，Huilin Xie,Zonghang Liu, Zhen Tian, Junyi Cai, Zheng Zhao, Zijie Qiu, Jianquan Zhang,* and Ben Zhong Tang*，ACS Nano，https://doi.org/10.1021/acsnano.5c08820
