内容提要
本研究开发的纳米颗粒具有独特的性质和多种功能，包括优异的光稳定性和热稳定性、在近红外二区（NIR-II）的强荧光发射、极高的光热转换效率、良好的生物相容性、显著的放射增敏特性以及在肿瘤部位的有效聚集。体外和体内评估表明，这些纳米颗粒是理想的候选者，可用于在近红外二区荧光、近红外一区光声和光热三模态成像引导下进行协同光热放射治疗。在放射治疗过程中，它们通过改善肿瘤缺氧微环境、调节细胞周期、诱导凋亡和免疫原性细胞死亡发挥放射增敏作用。
2TT-oC6B 纳米颗粒的合成与表征
为实现良好的水分散性和生物相容性，将这种聚集诱导发光团与美国食品药品监督管理局（FDA）批准的两亲性聚合物 1,2 - 二硬脂酰 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸乙醇胺 - N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-mPEG 2000）制成有机纳米颗粒。该聚集诱导发光团在四氢呋喃中分别在 700 nm 和 1020 nm 处出现吸收峰和发射峰。2TT-oC6B 纳米颗粒的吸收峰和发射峰分别位于 730 nm 和 1000 nm，适合用于近红外二区荧光成像。2TT-oC6B 纳米颗粒表现出优异的稳定性，即使在储存长达 6 个月后，其吸收和发射波长也几乎没有变化。我们利用四氢呋喃 / 水体系研究了聚集后的发射波动。在聚集诱导发光团中，随着水体积分数（fw）从 0 增加到 40%，荧光显著淬灭，这归因于暗态扭曲分子内电荷转移（TICT）态的形成。然而，当 fw 进一步从 40% 增加到 99% 时，在聚集诱导发光团固有的分子内运动受限（RIM）机制和 TICT 态受抑制的作用下，光致发光强度急剧增加。在激光照射 30 分钟内，2TT-oC6B 纳米颗粒的荧光强度没有明显变化，而吲哚菁绿（ICG）的荧光在激光照射下迅速下降。通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）对 2TT-oC6B 纳米颗粒的形貌和尺寸分布进行了表征。该纳米颗粒呈均匀的球形，平均直径为 92 nm，多分散指数（PDI）较低，为 0.157。在适当浓度下，2TT-oC6B 纳米颗粒的最高温度与激光强度呈正相关。同样，在合适的激光强度下，最高温度与纳米颗粒浓度也呈正相关。这些结果表明，在 808 nm 激光照射下，2TT-oC6B 纳米颗粒的产热可得到精确控制。值得注意的是，当浓度为 100 μg/mL 时，2TT-oC6B 纳米颗粒的水溶液在 808 nm 激光（1.0 W/cm²）照射 10 分钟后，温度稳定在 68.5°C，凸显了其优异的光热转换性能。此外，在 808 nm 激光照射下经过 6 次连续的加热 - 冷却循环后，2TT-oC6B 纳米颗粒仍保持着强劲且稳定的光热生成能力，未出现明显降解经计算，2TT-oC6B 纳米颗粒的光热转换效率（PCE）为 72.53%。
2TT-oC6B 纳米颗粒的体外治疗效果评估
研究人员对 2TT-oC6B 纳米颗粒进入细胞的能力进行了评估。为便于观察，还制备了异硫氰酸荧光素（FITC）标记的 2TT-oC6B 纳米颗粒。与纳米颗粒共培养 24 小时后，观察到 FITC-2TT-oC6B 纳米颗粒的荧光信号与溶酶体示踪剂红（LysoTracker Red）的荧光信号显著共定位，这表明 2TT-oC6B 纳米颗粒进入了 4T1 细胞并存在于溶酶体中。流式细胞术结果显示，随着孵育时间的延长，细胞内积累的 2TT-oC6B 纳米颗粒数量逐渐增加。这表明 2TT-oC6B 纳米颗粒能够在细胞内杀伤细胞并提高放射治疗的效果。2TT-oC6B 纳米颗粒优异的光热转换效率使研究人员推测其具有更强的光毒性和放射增敏特性。因此，采用 CCK-8 法评估了光热治疗联合放射治疗对 4T1 和 MDA-MB-468 细胞系的细胞毒性作用。结果显示，单独光热治疗或放射治疗组的细胞活力均有一定程度的下降，而光热治疗联合放射治疗组的细胞活力则显著下降。对于 4T1 细胞系，当 2TT-oC6B 纳米颗粒浓度达到 48μg/mL 时，纳米颗粒 + 近红外组的细胞活力下降了 43.6%，纳米颗粒 + 放射治疗组的细胞活力无显著下降，而纳米颗粒 + 近红外 + 放射治疗组的细胞活力几乎降至 0。对于 MDA-MB-468 细胞系，当 2TT-oC6B 纳米颗粒浓度达到 48μg/mL 时，纳米颗粒 + 近红外组的细胞活力下降了 24.4%，纳米颗粒 + 放射治疗组的细胞活力下降不明显，而纳米颗粒 + 近红外 + 放射治疗组的细胞活力下降了 90%。因此，单独的近红外激光照射或放射治疗都不能有效杀伤乳腺癌细胞，这限制了纳米颗粒在治疗中的临床应用。相比之下，光热治疗 + 放射治疗组对肿瘤细胞的清除效果更显著，表明 2TT-oC6B 纳米颗粒在癌症治疗中具有显著的协同作用。采用钙黄绿素 - AM / 碘化丙啶（CA/PI）法证实了 2TT-oC6B 纳米颗粒的细胞杀伤能力。无论细胞是否接受放射治疗，大多数经 PBS 处理的 4T1 细胞均显示出绿色荧光（钙黄绿素的标志），表明没有明显的死亡。与 2TT-oC6B 纳米颗粒孵育的细胞也显示出钙黄绿素的绿色荧光，证实了其低毒性。经过近红外激光照射或放射治疗后，4T1 细胞出现部分死亡并部分显示红色荧光。在激光照射和放射治疗的双重作用下，两种细胞系均出现明显死亡。MDA-MB-468 细胞的活 / 死染色结果与 4T1 细胞相似。放射治疗可通过作用于有机分子直接导致 DNA 断裂，其中双链 DNA 断裂被认为是最严重的 DNA 损伤形式，这可通过 γ-H2AX 检测来反映。研究人员检测了 4T1 细胞中的 DNA 损伤，以验证 2TT-oC6B 纳米颗粒的放射增敏作用。细胞接受放射治疗后，观察到少量绿色荧光，表明存在 DNA 损伤。相比之下，光热治疗联合放射治疗后，细胞显示出大量绿色荧光，这证实了放射治疗的增敏作用是由 2TT-oC6B 纳米颗粒介导的。共聚焦图像的半定量分析显示，联合治疗组细胞的 DNA 损伤更严重。每个细胞核中的 γH2AX 灶点也支持上述结论。这可能是由于 2TT-oC6B 纳米颗粒的热疗作用对细胞周期产生影响，导致更多细胞处于对放射治疗敏感的 G2 期，从而造成严重的 DNA 双链断裂。
为阐明细胞死亡机制，采用膜联蛋白 V-APC 检测法进行了流式细胞术分析。结果显示，经 2TT-oC6B 纳米颗粒联合激光照射和放射治疗后，77.9% 的 4T1 细胞发生晚期凋亡，而 21.9% 的癌细胞发生早期凋亡。然而，纳米颗粒 + 近红外组、放射治疗组和纳米颗粒 + 放射治疗组中分别只有 42.5%、11.4% 和 22.5% 的 4T1 细胞发生凋亡。这一显著差异表明，光热治疗联合放射治疗能诱导更多肿瘤细胞进入凋亡途径，从而更好地清除肿瘤。此外，研究人员还研究了光热治疗对 4T1 肿瘤细胞周期的影响。流式细胞术结果显示，未处理的肿瘤细胞处于 G1 期和 G2/M 期的比例分别约为 28.3% 和 16.6%。与 2TT-oC6B 纳米颗粒共孵育 24 小时的肿瘤细胞与正常细胞之间无显著差异。相比之下，激光处理后，处于 G1 期的细胞比例降至 6.97%，而处于 G2/M 期的细胞比例约增加了一倍。同时，实验结果表明，光热治疗后，停滞在 G2/M 期的细胞比例随时间逐渐增加。许多研究表明，高热可增加 G2 期细胞的比例。上述实验表明，光热治疗也可增加 G2 期细胞的比例。这可能是由于高温影响 DNA 修复酶的功能，激活检查点激酶，如 ATR-Chk1、p53 及其下游靶点 。一般认为，G2 期和 M 期细胞对放射治疗最敏感，因为 G2/M 期细胞更容易受到放射诱导的 DNA 损伤，且修复效率较低。同时，细胞周期检查点的激活也为触发凋亡提供了额外的时间。细胞形态的改变和流式细胞术结果表明，光热治疗联合放射治疗可诱导凋亡。通过蛋白质印迹分析检测了 2TT-oC6B 纳米颗粒联合治疗介导的凋亡相关蛋白的表达水平。Bcl-2 蛋白结合并抑制促凋亡蛋白，其表达在凋亡后通常会降低。半胱天冬酶（caspase）家族蛋白的激活是凋亡的典型特征，所有凋亡信号都汇聚于凋亡的最终执行者 —— 半胱天冬酶 - 3。在凋亡过程中可观察到活化的半胱天冬酶 - 3 的产生。结果显示，纳米颗粒 + 近红外 + 放射治疗组中 Bcl-2 的表达降低，半胱天冬酶 - 3 被激活并发生切割。这表明联合治疗显著诱导了凋亡的发生。
体内治疗效果
鉴于 2TT-oC6B 纳米颗粒在体外实验中表现优异，我们选择小鼠乳腺癌细胞系 4T1 作为动物实验的细胞模型，并建立荷瘤小鼠模型，以评估光热治疗（PTT）以及 2TT-oC6B 纳米颗粒协同放射治疗（RT）在体内的效果。乳腺癌肿瘤通常位于表浅部位，大量研究表明，基于瘤内注射的光热治疗可取得优异的治疗效果 [60]。在临床上，瘤内注射也常被用于肿瘤治疗。为降低对其他器官的潜在毒性、提高肿瘤部位的药物浓度，并更好地控制光热治疗时肿瘤的温度，我们选择采用瘤内注射进行肿瘤消融治疗。将小鼠随机分为 6 组：PBS 组、纳米颗粒组、纳米颗粒 + 近红外组、放射治疗组、纳米颗粒 + 放射治疗组（对照组）和纳米颗粒 + 近红外 + 放射治疗组（实验组）。当肿瘤体积约为 150 mm³ 时，给小鼠进行瘤内注射 2TT-oC6B 纳米颗粒或 PBS。为使 2TT-oC6B 纳米颗粒在肿瘤内更好地聚集，在注射 24 小时后进行激光照射和 / 或放射治疗。激光组在肿瘤部位用近红外激光（808 nm，1 W/cm²）照射 5 分钟，放射治疗组在肿瘤部位给予单次 4 Gy 剂量的照射。每 2 天对小鼠称重并测量肿瘤体积。当各组中肿瘤未完全消退的小鼠接受治疗后，随机选取部分小鼠进行免疫荧光和免疫组织化学实验。治疗结束时，处死所有小鼠，取出肿瘤并称重。
总结
本研究设计了 2TT-oC6B 纳米颗粒（NP），旨在通过单次光热治疗（PTT）提高单次低剂量放射治疗（RT）的疗效。研究证实，纯有机纳米颗粒可通过调节细胞周期、诱导凋亡和免疫原性细胞死亡以及改善肿瘤缺氧微环境来发挥放射增敏作用。在近红外（NIR）照射下，2TT-oC6B 纳米颗粒会产生大量热量，导致细胞周期重新分布，具体表现为 G2/M 期细胞比例增加。处于 G2/M 期的细胞对放射治疗相对敏感。同时，在光热治疗作用下，细胞会激活凋亡通路，具体表现为 Bcl-2（B 淋巴细胞瘤 - 2 基因）表达降低以及 Cleaved-Caspase-3（活化的半胱天冬酶 - 3）等表达增加，从而与放射治疗产生协同作用。光热治疗可通过损伤相关分子模式（DAMPs）激活免疫原性细胞死亡（ICD），具体表现为钙网蛋白（CRT）和三磷酸腺苷（ATP）增加，以及高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）减少。此外，近红外光诱导产生的热量可促进局部血液循环，降低缺氧指标缺氧诱导因子 - 1α（HIF-1α），进而提高肿瘤对放射治疗的敏感性。
参考文献
Organic Radiosensitizer with Aggregation Induced Emission Characteristics for Tumor Ablation through Synergistic Apoptosis and Immunogenic Cell Death ,Dalu Xie, Xueke Yan, Wenzhao Shang, Hao Ren, Wei Wen, Ben Zhong Tang,* and Huifang Su*,ACS Nano 2025, 19, 14972−14986,https://doi.org/10.1021/acsnano.5c00942
