内容提要
本文设计了一系列有机无重原子分子（命名为 CTU1、CTU2 和 CTU3），它们在第一近红外区和 NIR-II 区均表现出强吸收带。水分散性 CTU3 纳米颗粒（NPs）具有强烈的 J 聚集体特征和良好的 NIR-II 吸收带，在 1064 nm 光照射下能高效产生超氧阴离子（・O₂⁻）。此外，CTU3 纳米颗粒还具有 88.6% 的高光热转换效率。体外和体内实验表明，CTU3 纳米颗粒具有优异的光动力治疗（PDT）和光热治疗（PTT）效果，可在 4T1 荷瘤小鼠中进一步诱导免疫原性细胞死亡并激活免疫细胞，从而实现 PDT/PTT 联合抗肿瘤光免疫治疗，以对抗难治性肿瘤。
近红外一区和近红外二区激活的光敏剂的合成及其光物理性质研究
通过 Suzuki/Knoevenagel 缩合两步反应设计并合成了三种光敏剂，分别命名为 CTU1、CTU2 和 CTU3。CTU1、CTU2 和 CTU3 具有典型的 D-π-A-π-D 型结构，均结合了甲氧基 / 氨基修饰的三苯胺（TPA）电子供体和带有强吸电子三氟甲基（CF₃）基团（其吸电子能力强于甲基（-CH₃）和苯环）的强电子受体硼二吡咯亚甲基（BODIPY），以增强分子内电荷转移（ICT），从而使吸收红移。三种光敏剂在稀四氢呋喃（THF）溶液中在 700-1000 nm 范围内呈现宽吸收带，吸收峰分别位于 820、847 和 877 nm。此外，当水 / 四氢呋喃混合溶液中水的比例增加到 90% 时，CTU1、CTU2 和 CTU3 的最大吸收峰分别红移至 838、880 和 914 nm。接下来，进一步进行了粉末 X 射线衍射（XRD）分析。CTU2 和 CTU3 显示出清晰的 X 射线衍射峰，证实其固体中存在有序的分子堆积。然而，在 CTU1 的粉末中未观察到衍射峰。这些观察结果与图示一致，即 CTU1 在形成固体时红移最小，J 聚集程度最低。为了将 CTU1、CTU2 和 CTU3 用于体外和体内生物应用，通过超声介导的自组装将所得光敏剂制备成水分散性纳米脂质体（NPs）。CTU1、CTU2 和 CTU3 纳米颗粒的吸收光谱显示出显著红移，吸收峰分别位于 850、888 和 961 nm。这些结果表明，三种光敏剂在聚集状态下具有典型的 J 聚集体特征，其中两种纳米颗粒（CTU2 纳米颗粒和 CTU3 纳米颗粒）表现出明显的近红外二区吸收3。特别是，CTU3 纳米颗粒中含有的强供能基团氨基三苯胺（TPA）使其比 CTU1 纳米颗粒和 CTU2 纳米颗粒具有更显著的 J 聚集体特征，从而使其吸收光谱更宽。随后评估了 CTU1、CTU2 和 CTU3 纳米颗粒的近红外二区荧光，。其中，CTU1 纳米颗粒和 CTU2 纳米颗粒与其分子状态相比，在近红外二区显示出强烈的红移荧光（在四氢呋喃中的峰分别位于 982 和 1000 nm），发射中心分别位于 1034 和 1100 nm4。相比之下，即使在高浓度下，CTU3 纳米颗粒也未观察到明显的近红外二区荧光。一个可能的原因是，CTU3 纳米颗粒由于 J 聚集体特征而使其吸收红移至近红外二区，这会导致振动弛豫产生热量而非荧光。通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）成像观察到三种纳米颗粒具有统一的球形形貌，平均直径分别约为 225、195 和 164 nm。测定的 CTU1、CTU2 和 CTU3 纳米颗粒的 zeta 电位负值分别为 - 45.7、-39.4 和 - 22.0 mV，它们在水中储存 14 天仍显示出良好的稳定性。随后研究了纳米颗粒在近红外一区或近红外二区光照射下的活性氧（ROS）生成能力。采用 2'，7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为总活性氧指示剂，以指示在 808 或 1064 nm 光激活下的活性氧生成情况。在皮肤最大允许暴露量（808 nm 下 0.33 W・cm⁻² 和 1064 nm 下 1.0 W・cm⁻²，美国国家标准）的光照射下，磷酸盐缓冲溶液（PBS）没有明显的 DCFH 发射。相比之下，在存在任何一种纳米颗粒的情况下，都能在 525 nm 处观察到来自 DCFH 的强绿色荧光信号7。暴露于激光照射 30 分钟后，CTU1、CTU2 和 CTU3 纳米颗粒诱导的 DCFH 荧光分别提高了 43 倍、21 倍和 37 倍8。对于 CTU3 纳米颗粒，进一步证明了其活性氧生成具有光剂量依赖性。这些结果表明它们具有良好的光动力治疗（PDT）性能。接下来，采用单线态氧（¹O₂）指示剂 1,3 - 二苯基异苯并呋喃（DPBF）来评估三种光敏剂的单线态氧生成能力。仅 CTU1 光敏剂的 DPBF 吸收峰在暴露于 808 nm 激光（0.33 和 1.0 W・cm⁻²）后降低，而 CTU2 纳米颗粒和 CTU3 纳米颗粒在 DPBF 降解方面没有显示出任何显著变化10。这些结果表明，在近红外光激发下，CTU1 纳米颗粒可观察到 II 型光动力治疗效果，而 CTU2 纳米颗粒和 CTU3 纳米颗粒则不能。采用超氧阴离子（・O₂⁻）荧光探针（二氢罗丹明 123，DHR123）和羟基自由基（・OH）荧光探针（4 - 羟基苯基荧光素，HPF）来评估三种纳米颗粒的 I 型活性氧生成能力。在近红外一区和近红外二区光照射下，单独的 DHR123 未捕获到明显的荧光。相比之下，在相同的激发条件下，CTU1 纳米颗粒、CTU2 纳米颗粒和 CTU3 纳米颗粒的 DHR123 荧光强度分别增加了 1.83 倍、1.81 倍和 7.8 倍。然而，在光照射下，三组纳米颗粒均不能触发 HPF 的显著荧光变化。值得注意的是，CTU3 纳米颗粒即使在 0.33 W・cm⁻² 的低功率条件下也能产生超氧阴离子，表明 CTU3 纳米颗粒在近红外二区激活下具有高效的超氧阴离子生成能力。CTU1 纳米颗粒是 808 nm 激发的 I 型和 II 型光敏剂，而 CTU2 纳米颗粒（808 nm 激发）和 CTU3 纳米颗粒（1064 nm 激发）是具有明显超氧阴离子生成能力的 I 型光敏剂。此外，采用电子顺磁共振（EPR）测量，以 5,5 - 二甲基 - 1 - 吡咯啉 N - 氧化物（DMPO）作为自旋捕获剂，验证超氧自由基的生成。仅在照射下的 CTU3 纳米颗粒中观察到具有强强度的自旋捕获剂 DMPO 与超氧阴离子加合物的典型 EPR 光谱，这与先前报道的结果一致，进一步表明 CTU3 纳米颗粒是一种高效的近红外二区激发的 I 型光敏剂。
体外抗肿瘤活性
利用细胞计数试剂盒 - 8（CCK-8）测定法评估了 CTU3 纳米颗粒对 4T1 和 A549 肿瘤细胞的细胞毒性。在设定的浓度范围内，4T1 和 A549 细胞经 CTU3 纳米颗粒处理 24 小时后，未观察到明显的细胞死亡，表明 CTU3 纳米颗粒具有良好的生物安全性。相比之下，在 1064 nm 激光照射下，随着纳米颗粒浓度的增加，4T1 和 A549 细胞的存活率降低。在 1.0 W・cm⁻² 激光照射下，CTU3 纳米颗粒对肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）约为 20 μg・mL⁻¹，证明了 CTU3 纳米颗粒有效的光毒性。此外，钙黄绿素 - AM / 碘化丙啶（AM/PI）活 / 死细胞染色证实了 CTU3 纳米颗粒在 1064 nm 光照射下对肿瘤细胞的杀伤效率。利用 DCFH-DA 和二氢乙锭（DHE）作为指示剂，进一步评估了 CTU3 纳米颗粒在细胞内的总活性氧和・O₂⁻生成能力。三个对照组未捕获到可检测的信号，而 CTU3 纳米颗粒 + 激光组的细胞产生了明亮的绿色和红色荧光，证明了纳米颗粒在激光照射下在 4T1 细胞内产生了显著的总活性氧和・O₂⁻。重要的是，在 0.5 W・cm⁻² 激光条件下也捕获到了绿色和红色荧光信号，进一步表明 CTU3 纳米颗粒可在低功率条件下用于抗肿瘤光动力治疗应用（IC₅₀约为 30 μg・mL⁻¹）。之后，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的纳米颗粒来评估 CTU3 纳米颗粒的细胞内定位，该标记为细胞内追踪提供绿色荧光。红色溶酶体追踪剂和蓝色细胞核追踪剂 4'，6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）被用作共标记测定的对照。4T1 细胞与 CTU3 纳米颗粒孵育 3 小时后，显示出明亮的合并黄色荧光信号，表明纳米颗粒位于细胞溶酶体中。然后，评估了乳酸脱氢酶（LDH）的释放，以证明细胞受到 CTU3 纳米颗粒的光损伤。纳米颗粒 + 激光组的 LDH 水平（52%）远高于其他三组，表明 4T1 细胞在光激活下会受到纳米颗粒的损伤。总之，这些结果表明，用近红外二区光激活的 CTU3 纳米颗粒将对肿瘤细胞的杀伤表现出良好的光毒性。利用免疫原性细胞死亡诱导剂奥沙利铂（OXP，20 μg・mL⁻¹）和已报道的光敏剂（TPC，经 808 nm 激光照射）作为阳性对照组，研究了 CTU3 纳米颗粒对 4T1 细胞诱导的免疫原性细胞死亡效应。免疫原性细胞死亡与多种生化标志物相关，包括钙网蛋白（CRT）的暴露、高迁移率族蛋白 1（HMGB-1）释放到核外区以及大量 ATP 的分泌，这些能够促进体内抗原呈递并激活细胞毒性 T 淋巴细胞（CTLs），从而进一步增强抗肿瘤效果。PBS、PBS + 激光、纳米颗粒和奥沙利铂组未捕获到绿色荧光信号；而 CTU3 纳米颗粒 + 激光组和 TPC 纳米颗粒 + 激光组显示出强绿色荧光，表明 CTU3 纳米颗粒在激光照射下可诱导 CRT 暴露。此外，CTU3 纳米颗粒 + 激光组、TPC 纳米颗粒 + 激光组和奥沙利铂组的红色荧光信号明显弱于对照组，进一步表明在激光激活下用 CTU3 纳米颗粒处理后，HMGB-1 蛋白丢失。然后，使用生物发光检测试剂盒测量细胞中的 ATP 水平。结果显示，4T1 肿瘤细胞中的 ATP 水平从 267 nmol・L⁻¹（PBS 组）降至 22 nmol・L⁻¹（纳米颗粒 + 激光组），而仅激光照射和仅纳米颗粒处理的细胞中的 ATP 水平分别为 250 和 256 nmol・L⁻¹，表明肿瘤细胞在受损后会发生 ATP 的细胞外分泌。在 1064 nm 激光照射下，CTU3 纳米颗粒可诱导免疫原性细胞死亡，其效率超过奥沙利铂在肿瘤细胞中的效率。
体内抗肿瘤光免疫治疗
利用红外相机记录到在 10 分钟的激光照射内，温度从 31.5℃迅速升至 53.5℃，这符合肿瘤热疗所需的温度。相比之下，在相同条件下，对照组仅观察到可忽略不计的温度升高。这些结果表明，纳米颗粒在肿瘤的光热成像中表现良好，这极大地促进了随后的肿瘤部位特异性光疗，并有效避免了对正常组织的不必要损伤。进一步评估了在近红外二区激光（1064 nm，1.0 W・cm⁻²，10 分钟）激活下，CTU3 纳米颗粒对 4T1 乳腺癌的杀伤活性。CTU3 纳米颗粒 + 激光组处理的小鼠的实体瘤被完全消除，并且在随后的 20 天内没有任何复发，而包括奥沙利铂在内的阴性和阳性组的肿瘤具有相似的生长趋势，表明 CTU3 纳米颗粒在近红外二区光照射下可有效抑制体内 4T1 肿瘤的生长。为了更深入地了解 CTU3 纳米颗粒在 1064 nm 激光照射下在小鼠中诱导的抗肿瘤免疫应答背后的潜在机制，我们进一步分析了抗肿瘤应答中最直接和关键的效应细胞 ——CD8⁺细胞毒性 T 淋巴细胞，以及肿瘤应答性 CD4⁺辅助性 T 细胞（Th），后者已被证明可增强 CD8⁺细胞毒性 T 淋巴细胞的抗肿瘤活性。此外，细胞因子如肿瘤坏死因子 -α、干扰素 -γ 和白细胞介素 - 6 是激活机体 T 细胞介导的免疫应答的三个重要指标，其水平越高，免疫应答越强。CTU3 纳米颗粒 + 激光组小鼠血清中的肿瘤坏死因子 -α、干扰素 -γ 和白细胞介素 - 6 水平显著升高至 220、324 和 109 pg・mL⁻¹，而奥沙利铂组分别为 142、51 和 21 pg・mL⁻¹。这些综合结果强烈表明产生了有效的、持久的抗肿瘤免疫应答，有效阻止了肿瘤的进展。
总结
本文通过从头设计策略，获得了一系列具有显著 J 聚集体特征的近红外激活光敏剂，实现了从 I 型和 II 型活性氧（ROS）向仅 I 型活性氧的调控。其中，吸收峰最短（850 nm）的 CTU1 纳米颗粒（NPs）可产生 I 型和 II 型活性氧；相比之下，吸收中心位于 880 nm 的 CTU2 纳米颗粒和吸收中心位于 961 nm 的 CTU3 纳米颗粒仅通过 I 型途径产生超氧阴离子（・O₂⁻）。研究发现 CTU3 纳米颗粒具有 88.6% 的高光热转换效率（PCE），可用于热成像引导的光热治疗（PTT）。即使在低功率条件下，经 1064 nm 激光照射的 CTU3 纳米颗粒对 4T1 和 A549 癌细胞仍具有光毒性，这一性能优于已报道的近红外二区激活光敏剂。以免疫原性细胞死亡（ICD）诱导剂奥沙利铂（OXP）为对照，CTU3 纳米颗粒对肿瘤组织表现出不可逆的细胞毒性，可显著消融实体瘤并在肿瘤内触发免疫原性细胞死亡，具体包括：体外实验中钙网蛋白（CRT）表达增强、高迁移率族蛋白 1（HMGB-1）渗出及三磷酸腺苷（ATP）分泌增加；体内实验中细胞毒性 T 细胞和促炎因子水平提高。
参考文献
De Novo Design of Efficient NIR-II-Activated Heavy-Atom-Free Type-I Photosensitizer for Anti-Tumor Photoimmunotherapy, Huan Chen, Yu Wang, Zhangxin He, Yingpeng Wan, Chen Cao, Ziwei Lu, Yijian Gao, Xiao Cui, Ka-Wai Lee, Ji-Hua Tan, Wenchang Xu, Yuliang Yang, Xiliang Li, Yali Wang,* Jianquan Hou, Shengliang Li,* and Chun-Sing Lee*, Adv.Mater.2025,2501919. https://doi.org/10.1002/adma.202501919.
