内容提要
基于激子耦合效应，通过非共轭的邻 / 间 / 对 - 双（溴甲基）苯连接体在 N - 吲哚位点连接两个 Cy5.5 分子，开发了花菁二聚体（2o-Cy、2m-Cy 和 2p-Cy）。这些二聚体表现出显著增强的摩尔消光系数以及令人满意的三线态激发态量子产率（32−44%）和寿命（10.6−11.9 微秒），从而在常氧和缺氧条件下均能显著增强活性氧物种的生成，并具有高效的抗肿瘤活性。2p-Cy 纳米粒子（NPs）可通过光诱导的天然免疫激活来消融原发肿瘤、抑制远处肿瘤生长并防止转移灶再生。
结果与讨论
2X-Cy（2o-Cy、2m-Cy 和 2p-Cy）二聚体的合成路线如 图所示。2X-Cy 和 Cy5.5 在约 690 nm 处显示出相似的最大吸收峰，但 2X-Cy 在约 640 nm 处出现明显的分裂吸收峰，且随着两个 Cy5.5 单元间距的增大，峰强度增加，表明激子耦合效应增强。重要的是，与 Cy5.5 单体（1ε=25×10⁴ M⁻¹ cm⁻¹）相比，2X-Cy 的摩尔消光系数（ε=32−45×10⁴ M⁻¹ cm⁻¹）显著提高，超过了文献中大多数花菁染料。Cy5.5 的最大发射1波长位于 721 nm，荧光量子产率（Φ_F）为 33%，而 2X-Cy 的发射红移至约 730 nm，Φ_F 降低（分别为 8%、5% 和 10%）。二聚体形成后，2X-Cy 的荧2光量子产率低于单体，这意味着 2X-Cy 吸收的光能可更有效地转移至三线态激发态，从而比 Cy5.5 更高效地生成 ROS。为验证这一假设，以 1,3 - 二2苯基异苯并呋喃（DPBF）为探针研究了单线态氧（¹O₂）的生成效率。在 660 nm 激光照射下，DPBF 的吸收快速下降，证实了高效的 ¹O₂生成。2o-Cy（15.8%）、23m-Cy（18.4%）和 2p-Cy（26.8%）的 ¹O₂产率远高于 Cy5.5（8.2%）和大多数已报道的花菁基光敏剂
2X-Cy 在水溶液中表现出明显的自组装特性，导致吸收展宽。2X-Cy 纳米粒子（NPs）16的稳定性直接影响递送效率和生物利用度。通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征，2X-Cy NPs 呈均匀球形。2p-Cy NPs 表现出优异16的稳定性，在 4°C 下 8 小时后尺寸变化可忽略不计。相比之下，在相同条件下，2o16-Cy NPs 和 2m-Cy NPs 的尺寸明显增加，这一趋势在 10% FBS-DMEM 培养基和 1% BSA - 磷酸盐缓冲液（PBS）中得到进一步证实。此外，测量了 2X-Cy NP16s 在 PBS 中的 zeta 电位，由于空间结构的变化，自组装的 2X-Cy NPs 在纳米状态下表现出不同的 zeta 电位，从而显示出不同的稳定性水平。具体而言，2p-Cy NPs16的高 zeta 电位值表明其纳米粒子稳定性最佳，这与先前的理论计算数据一致。在 1% BSA-PBS 溶液中16自组装后，2X-Cy NPs 的 DLS 显示尺寸显著增加，稳定性明显增强，表明 2X-Cy 可通过静电吸附与 BSA 结合，从而生成稳定性优异的纳米粒子。此外，自组装后，2X-Cy 16NPs 在 660 nm 激光照射（50 mW cm⁻²，20 分钟）下表现出显著的光稳定性，在整个实验过程中吸收光谱几乎保持不变。
随后，使用 DHR123、SOSG、DHE 和 HPF 探针分别评估总 ROS、¹O₂、超氧阴离子（・O₂⁻）和羟基自由基（・OH）的水平。2X-Cy NPs 可生成 ¹O18₂、・O₂⁻和・OH 物种，且它们之间也存在显著差异。例如，由于电子转移特性，2o-Cy NPs 主要生成・O₂⁻，而 2m-Cy NPs 由于其独特的 ICT 特性，倾向于生成 ¹O₂和・OH。不同的是，2p-Cy NPs19表现出强烈的 ¹O₂生成倾向。总体而言，与 Cy5.5 相比，192X-Cy NPs 的 ROS 生成显著增强。使用激光扫描共聚焦显19微镜（LSCM）在 MCF-7 肿瘤细胞和 MCF-10A 正常细胞中检测了 2X-Cy NPs 的细胞内摄取和定位。2X-Cy NPs 被肿瘤细胞有效内化，孵育 15 分钟后出现明显荧光。这种快速摄取可归因于肿瘤细胞20比正常细胞具有更高的电子亲和力和更丰富的表面蛋白，导致阳离子 2X-Cy NPs 在正常组织中的内化较慢。此外，用秋水仙素预处理显著损20害了 2X-Cy NPs 的细胞积累，这可能是由于其对细胞表面蛋白的破坏作用以及随后对内吞途径的抑制。这些观察结果强烈表明 2X-C20y NPs 的摄取机制是细胞表面蛋白介导的。同时，对细胞的长期成像显示，203 小时后荧光强度显著降低。考虑到 2X-Cy NPs 的优21异稳定性，我们认为这种降低反映了它们的快速细胞代谢和排泄，进一步支持了其良好的生物安全性。此外，荧光与商业线粒体追踪染21料 MitoTracker Green 重叠，皮尔逊系数为 0.88，表明它们特异性定位在线粒体中。此外，通过分别使用 S21OSG、DHE 和 HPF 探针测定细胞内 ¹O₂、・O₂⁻和・OH 的水平，评估了细胞内 ROS 的生成。激光照21射后，细胞呈现明亮的绿色（SOSG-EP）或红色（DHE）荧光，表明细胞内生成了 ¹O₂和・O₂⁻。特别是，2m-Cy NPs 在21激光照射后显示出强烈的・OH 信号。这些结果表明，2X-Cy N21Ps 在介导 I 型和 II 型 PDT 方面具有双重功效，突出了其在常氧（21% O₂）和缺氧（2% O₂）微环境中强大的治疗应用潜力。
在 2X-Cy NPs 介导的 PDT 后，评估了细胞线粒体的完整性。JC-1 染色图像显示，2X-Cy 表现出良好的生物相容性，其中 JC-1 染料以聚集形式存在，具有明亮的红色荧光。然而，在激光照射下，2X-C22y NPs 介导的 PDT 诱导了线粒体膜电位的明显去极化，这通过 JC-1 染料从聚集形式转变为单体形式得以证明，其特征是明显转变为绿色荧光发射。这些发现与用羰基氰化物间氯苯15腙（CCCP）处理的阳性对照组中观察到的结果一致。通常，去极化的细胞倾向于发生15凋亡。因此，使用 Annexin V15-FITC/PI 试剂盒研究了 2X-Cy NPs 处理的 MCF-7 细胞的死亡途径。在 2o-Cy NPs 和 2m-15Cy NPs 组中，线粒体损伤诱导的凋亡是主要的细胞死亡机制。相比之下，2p-Cy NPs15组主要表现为坏死（60%），凋亡极少（2.7%）。此外，进行了钙黄绿素 - AM 和15PI 荧光染色测试，通过区分活细胞（绿色荧光）和死细胞（红色荧光）来证明 2X-Cy NPs 对肿瘤细胞的杀伤作用。在空白和对照（无激光照射）组15中观察到强烈的绿色荧光，表明处理后细胞的高存活率。相反，在常氧和缺氧微环境中，15用 660 nm 激光照射处理后，与 2X-Cy NPs 孵育的肿瘤细胞呈现强烈的红色荧光和可忽略的绿色荧光，表明 2X-Cy NPs 介导的 PDT 对肿瘤细胞具有优异的光毒性。值得注意的是，其中 2p-Cy15 NPs 表现出最显著的性能。
焦亡被认为是一种新的程序性炎症细胞死亡模式，其伴随细胞形态改变、促炎细胞因子释放和蛋白质表达变化。在激光照射下，与 2p-Cy NPs 孵育的细胞表现出坏死信号，并呈现焦亡的特征性形态学特征，如细胞肿胀和形成气泡状突起。此外，这些囊泡的大小随时间逐渐增大，最终破裂，导致细胞质外流和随后的细胞坏死。图中的 CRT 免疫荧光染色显示，在与 2p-Cy NPs 孵育的细胞经光照后，CRT 荧光信号明显增强。此外，HMGB1 免疫荧光染色图像显示，经激光照射的 2p-Cy NPs（2p-Cy NPs + L）处理后，细胞核内的 HMGB1 荧光信号几乎消失，表明其从细胞核释放到细胞外基质中。这些发现表明，与 2p-Cy NPs 孵育的 MCF-7 细胞在激光照射下发生焦亡，并伴随促炎细胞因子 CRT 和 HMGB1 的释放。此外，乳酸脱氢酶（LDH）、三磷酸腺苷（ATP）和 HMGB-1 逐渐泄漏到细胞外液中也是焦亡的特征性表现。用 2p-Cy NPs + L 处理的 MCF7 细胞将 LDH、ATP 和 HMGB-1 释放到上清液中，证实了通过膜破裂和细胞质内容物释放的焦亡性细胞死亡。
通过皮下注射 4T1 细胞建立双侧肿瘤模型（原发和远处肿瘤），旨在评估 2p-Cy NPs 在 PDT 中的原发抗肿瘤功效以及对远处和转移性肿瘤的 PDIT 治疗效果。当原发肿瘤体积达到～100 mm³ 时，通过尾静脉向小鼠静脉注射 2p-Cy NPs，随后进行荧光成像以确定其分布。正如预期的那样，由于其阳离子结构，2p-Cy NPs 优先在肿瘤内积累，注射后 15 分钟即可将肿瘤与相邻组织区分开来。同时，2p-Cy NPs 的积累和代谢主要发生在肝和脾组织中。在 180 分钟后，肿瘤部位的荧光强度显著降低，表明 2p-Cy NPs 的快速代谢。考虑到肿瘤部位的最大荧光强度在约 60 分钟时达到，在此时间范围内进行 PDT 治疗。对照组（单独使用 2p-Cy NPs）在整个治疗期间表现出明显的肿瘤增殖，表明对肿瘤生长没有抑制作用，其肿瘤生长速率与 PBS 组一致。然而，在激光照射后，实验组（2p-Cy NPs + L）表现出优异的抗肿瘤功效，一些肿瘤甚至完全消失。在 PBS 组和对照组中，远处肿瘤继续生长，而在 PDIT 组中，肿瘤生长被有效抑制。
结论
本研究通过在两个典型 Cy5.5 单体的 N - 吲哚位点以邻 / 间 / 对 - 双（溴甲基）苯基团进行非共轭连接，开发了 2X-Cy 花菁二聚体（2o-Cy、2m-Cy 和 2p-Cy）。与 Cy5.5 相比，2X-Cy 二聚体表现出增强的摩尔吸收系数、长三重激发态寿命、高三重激发态产率以及高效的活性氧（ROS）生成能力，这归因于其通过激子耦合瞬态态实现的快速系间窜越（ISC）过程。理论计算表明，2X-Cy 具有较大的跃迁偶极矩和两个构象跃迁之间相对较低的能量差，从而导致分子间激子耦合的产生。在激光照射下，2p-Cy NPs 不仅表现出光动力治疗（PDT）特性，还能诱导半胱天冬酶 - 1 序列切割，引发有效的半胱天冬酶 - 1/GSDMD 依赖性焦亡。令人惊讶的是，2p-Cy NPs 在小鼠肿瘤模型中表现出优异的体内抗肿瘤效果，这表明其在消除原发肿瘤、持续抑制远处肿瘤生长以及有效预防肺转移方面的潜在应用价值。本研究开发的非共轭二聚体平台代表了基于激子耦合的光敏剂的一个有前途的范例，在光免疫治疗中具有重要的应用潜力。
参考文献
Tuning Exciton Coupling of Non-Conjugated Cyanine Dimers for Efficient Photodynamic Immunotherapy,Hua Gu, Puan Yuan, Juan Zhang, Xiang Xia, Qingze Pan, Wenkai Liu, Xueze Zhao, Wen Sun, Jianjun Du,* Jiangli Fan,* and Xiaojun Peng,J. Am. Chem. Soc.,https://doi.org/10.1021/jacs.5c04044
