内容提要
传统的半菁染料通过引入苄基硝基苯用于生物成像和光动力治疗。由于吲哚盐的吸电子作用相对较弱，该染料具有较长的吸收波长，对 NTR 的响应缓慢且斯托克斯位移小。因此，我们选择具有强吸电子能力的吡啶盐来取代吲哚部分。吸电子能力的增强导致电荷分布不均，从而缩短共轭长度，致使吸收蓝移且斯托克斯位移增大。此外，将硝基直接连接在荧光团的另一侧以提高染料的还原电位。通过这种方式，不仅 NTR 能快速响应硝基，而且光敏染料易于发生电子转移，从而实现 I 型光动力治疗。我们发现通过这种性能优异的探针进行生物成像，HIF-1α 可以调节 NTR 水平，HIF-1α 抑制剂能抑制 NTR 的表达，而 NTR 抑制剂对 HIF-1α 的抑制无效。
NTR 荧光探针的设计与性质
使用常规合成步骤制备了半菁（HC-OH），并通过引入吡啶基团制备了（E）-4-（2-（6 - 羟基 - 2,3 - 二氢 - 1H - 呫吨 - 4 - 基）乙烯基）-1 - 甲基吡啶 - 1 - 鎓（Xan-P-OH）。与HC-OH（20 nm）相比，Xan-P-OH 的斯托克斯位移显著增加至 135 nm。大斯托克斯位移将为成像监测提供高信噪比，使其更加可靠。在 Xan-P-OH 骨架中引入苄基硝基苯，得到化合物（E）-1 - 甲基 - 4-（2-（6-（（4 - 硝基苄基）氧基）-2,3 - 二氢 - 1H - 呫吨 - 4 - 基）乙烯基）吡啶 - 1 - 鎓（Xan-P-1），使其能够响应 NTR。结果表明，Xan-P-1 对 NTR 的响应速率较慢，这严重阻碍了其进一步的生物成像应用。为了解决这一问题，我们用硝基苯取代了传统的苄基硝基苯。我们推测，这种共轭连接可以使探针中吡啶阳离子盐的吸电子效应更强地影响反应位点，从而使其更容易被还原。因此，制备了探针（E）-1 - 甲基 - 4-（2-（6 - 硝基 - 2,3 - 二氢 - 1H - 呫吨 - 4 - 基）乙烯基）吡啶 - 1 - 鎓（Xan-P-2）。正如预期的那样，与 Xan-P-1 相比，Xan-P-2 具有更高的还原电位，并且响应速率显著提高。为了进一步证明我们关于反应速率增强机制的猜想，我们合成了不含正离子的探针（E）-4-（2-（6 - 硝基 - 2,3 - 二氢 - 1H - 呫吨 - 4 - 基）乙烯基）吡啶（Xan-P-3）。结果显示，Xan-P-3 的响应速率显著降低，这进一步验证了我们的概念。需要指出的是，由于烷基链较短，Xan-P-2 的细胞渗透性有限（log P=0.823），不适合内源性 NTR 的检测。随后，我们进一步延长了 Xan-P-2 的烷基链长度，得到了探针（E）-4-（2-（6 - 硝基 - 2,3 - 二氢 - 1H - 呫吨 - 4 - 基）乙烯基）-1 - 丙基吡啶 - 1 - 鎓（Xan-P-4）。Xan-P-4 的 LogP 值为 1.105，表明其具有良好的细胞渗透性。在 PBS 缓冲液（10 mM，pH 7.4）中进行的荧光光谱分析显示，Xan-P-4 与 NTR 反应后，吸收峰红移至 530 nm，695 nm 处的荧光强度增强了 61.18 倍，同时伴随明显的颜色变化（从橙色变为粉红色）。显然，反应产物 Xan-P-(NH2)具有较大的斯托克斯位移（165 nm），这对生物成像非常有利。由于 NTR 对氧气高度敏感，反应速率是评估 NTR 探针的关键指标。因此，测定了 Xan-P-4 与 NTR 在 695 nm 处的荧光动力学。加入 NTR 后，Xan-P-4 的荧光强度迅速增加，4 分钟内反应完成 86%。
细胞与肿瘤的缺氧成像
受 Xan-P-4 对 NTR 出色的荧光响应启发，其被进一步用于活细胞和生物体的缺氧成像研究。在进行缺氧成像前，采用 CCK-8 法评估了 Xan-P-4 在 4T1 细胞（小鼠乳腺癌细胞）中的细胞毒性。结果显示，50 μM 的 Xan-P-4 对 4T1 细胞的毒性极低。随后，在不同氧含量环境（211% O₂、6-12% O₂和 0.1% O₂）中培养的 4T1 和 MCF-7 细胞中，测试了 Xan-P-4 的 NTR 传感能力。仅在缺氧条件下细胞呈现明显的荧光信号，而在常氧和微氧环境中无荧光。在缺氧环境中孵育并使用 NTR1抑制剂双香豆素处理后，红色通道荧光消失，进一步验证了 Xan-P-4 对细胞内 NTR 的选择性。这些结果表明，Xan-P-41适用于监测活细胞中的缺氧情况。此外，通过共定位实验研究了 Xan-P-4 的亚细胞分布。当 HeLa 细胞用 Xan-P-4 与线粒体绿色荧光染料（Mito-Green）/ 溶酶体绿色荧光染料（Lyso-Green）共标记时，皮尔逊共定位系数分别为 0.94 和 0.55，表明 Xan-P-4 可特异性定位于缺氧细胞的线粒体。
体外光动力治疗效果评估
为探究 Xan-P-4 在 NTR 激活后产生活性氧（ROS）的能力，分别采用 DPBF（1,3 - 二苯基异苯并呋喃，ROS 捕获剂）、DHR123（二氢罗丹明 123，O₂⁻捕获剂）和 SoSG（单线态氧绿色传感器）对总 ROS、O₂⁻和 ¹O₂进行检测 [31]。结果显示，在 660 nm 激光照射下，含 Xan-P-4 的 DPBF 溶液紫外吸收峰几乎消失，表明几乎无 ROS 生成；而还原产物 Xan-P-NH₂在 660 nm 激光照射下短时间内即可产生大量 ROS。这表明 Xan-P-4 可作为肿瘤特异性光敏剂用于光动力治疗。更重要的是，O₂⁻和 ¹O₂检测实验表明，NTR 激活的 Xan-P-4 仅使 SoSG 荧光轻微增强，而 DHR123 荧光强度显著增强 2.7 倍，说明 Xan-P-4 经 NTR 激活后产生的 ROS 主要为 O₂⁻而非 ¹O₂。这些实验结果证实，Xan-P-4 经 NTR 激活后可产生 O₂⁻，可用作耐缺氧光动力治疗的 I 型光敏剂。在 4T1 细胞中测试 NTR 介导的可激活型 I 型光毒性。分别使用 DCFH-DA（活性氧指示剂）、DHR123 和 SoSG 评估光疗后活细胞中 ROS、O₂⁻和 ¹O₂的生成情况。在探针孵育后激光照射条件下，Xan-P-NH₂+ 激光组和 Xan-P-4 + 激光 + 缺氧组中 DCFH-DA 和 DHR123 的荧光显著增强，而两组中 SoSG 的荧光均未增强。这些现象表明，细胞内的 Xan-P-NH₂在激光照射下可产生大量 O₂⁻，而 Xan-P-4 需在缺氧癌细胞中经 NTR 激活后才能产生 O₂⁻。随后，通过钙黄绿素 - AM（活细胞，绿色通道）和碘化丙啶（死细胞，红色通道）直观评估细胞杀伤效果。在常氧状态下，仅 Xan-P-NH₂+ 激光组可观察到明显红色荧光，无绿色荧光；在缺氧条件下，Xan-P-4 + 激光组的绿色荧光较 Xan-P-4 组减弱，且出现红色荧光。通过 CCK-8 检测进一步评估 Xan-P-4 的光动力治疗效果。在 20、50、100、200 和 300 mW/cm² 的 660 nm 激光照射下，100 mW/cm² 时的光动力治疗效果最佳，且治疗效率随照射时间延长而提高。基于上述结果，选择 100 mW/cm² 和 20 分钟作为后续实验的激光功率和照射时间，用于研究光疗诱导的癌细胞死亡。激光照射后，Xan-P-4 组的细胞存活率与未照射组基本一致，表明其毒性较低；Xan-P-NH₂组的细胞存活率随浓度增加而急剧下降，Xan-P-4 + 缺氧组的细胞存活率也随浓度增加呈下降趋势。综上所述，Xan-P-4 可被缺氧条件下产生的 NTR 特异性激活，通过产生 O₂⁻杀伤癌细胞，展现出其在抗缺氧光动力治疗中的巨大潜力。
体内肿瘤抑制功效评估
受 Xan-P-4 在体外光动力治疗（PDT）实验中优异效果的启发，我们将其应用于体内移植瘤抑制实验。将荷瘤小鼠随机分为 4 组（n=3），并给予不同处理。Xan-P-4 + 激光组和 PBS + 激光组的小鼠在瘤内注射 1 小时后，接受 660 nm（200 mW/cm²，20 分钟）激光照射。连续 14 天监测小鼠的肿瘤体积和体重。显然，无论是否光照，PBS 组的肿瘤体积均快速增长。Xan-P-4 组的肿瘤生长速率与 PBS 组相似，表明在黑暗条件下其毒性较低。在 PDT 组中，激光照射后肿瘤生长被显著抑制，证明 Xan-P-4 具有有效的肿瘤光消融作用。同时，各组小鼠的体重保持稳定。苏木精 - 伊红（H&E）染色显示，仅 PDT 组出现肿瘤细胞坏死（黄色箭头）和局部出血（蓝色箭头）。这些结果证实，Xan-P-4 可作为有效的光敏剂抑制肿瘤生长。
结论
针对传统 NTR 探针的不足，我们通过化学基团调控策略大幅改善了探针的光化学和光物理性质。该探针不仅对 NTR 响应迅速，还具备高信噪比和主动 I 型光动力效应。在本研究中，借助免疫荧光标记和荧光成像技术，我们首次揭示了 HIF-1α 通过调控 NTR 水平来调节肿瘤微环境并影响光动力治疗效果。这一发现为进一步揭示肿瘤演变机制和发现新的肿瘤治疗靶点奠定了理论基础。
参考文献
NTR rapidly activated photosensitizers for high-signal-to-noise imaging and type I photodynamic therapy,Xingwei Li , Jiahong Ai , Yurong Zhang , Fangjun Huo *,CaixiaYin*,NanoToday63(2025)102768,https://doi.org/10.1016/j.nantod.2025.102768
