内容提要
本文提出了一种新的分子设计策略，旨在开发卓越的光免疫治疗剂，将聚集诱导发射（AIE）活性、线粒体靶向、高效活性氧生成和高光热转换能力整合到单个分子中。经过策略设计的目标分子（TPETTBI）可发挥显著的光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT）效应，导致肿瘤细胞死亡。更重要的是，PDT 和 PTT 的协同作用可进一步诱导线粒体功能障碍，并触发大规模免疫原性细胞死亡（ICD），从而实现持久的抗肿瘤免疫效应。
分子设计合成与光物理性质
本研究旨在引入吲哚鎓基团，以改善荧光团的吸收和发射能力，以及线粒体靶向能力。在初步设计的分子MTPAI 中，选择 4,4'- 二甲氧基三苯胺作为 AIE 单元和供体单元，通过双键与受体单元连接。为了进一步改善 AIE 性能并实现发射波长的红移，TPETTI 引入了额外的可旋转单元和扩展的 π- 共轭体系。此外，为了增强目标分子的吸收，引入了 1,1,2 - 三甲基 - 1H - 苯并 [e] 吲哚。该修饰可提供最高的 D-A 强度，有望实现最长的发射波长。据此，设计并合成了三种具有不同 D-A 强度和共轭度的新型 D-A 型化合物。MTPAI、TPETTI 和 TPETTBI 分别在 540、567 和 576 nm 处表现出强烈的吸收。正如预期，具有扩展 π- 共轭结构的 TPETTI 和 TPETTBI 呈现出更长的吸收光谱。TPETTI 和 TPETTBI 的部分吸收光谱落在生物组织透明窗口（650–950 nm）内，这表明它们在深层组织诊疗应用中具有巨大潜力。它们的发射波长呈现出从 MTPAI 到 TPETTI 再到 TPETTBI 的逐渐延长趋势。这种顺序可归因于 TPETTI 和 TPETTBI 的 π- 共轭扩展和 D-A 强度增强。重要的是，TPETTI 和 TPETTBI 的发射光谱延伸至近红外区域，可能为体内成像提供更好的兼容性。随后，在 DMSO / 水混合物中研究了这三种化合物的 AIE 性质。随着水含量的增加，TPETTI 和 TPETTBI 的发射强度均增强，表现出典型的 AIE 特征。
为了评估整体光诱导 ROS 生成能力，使用 2',7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为指示剂。在光照射下，DCFH 的荧光无明显变化，而在 MTPAI 存在下荧光逐渐增加。对于 TPETTBI，照射后荧光增加并在 10 秒内达到平台期。TPETTI 组显示出类似的变化。这些结果表明 TPETTI 和 TPETTBI 均具有优异的 ROS 生成能力。值得注意的是，TPETTBI 和 TPETTI 的 ROS 生成能力优于商业光敏剂，如玫瑰红（RB）和 Ce6。
为了确定生成的特定 ROS 种类，分别使用蒽二基双（亚甲基）二丙二酸（ABDA）和二氢罗丹明 123（DHR123））来检测单线态氧（¹O₂）和超氧阴离子（O₂・⁻）的生成。在 TPETTI、TPETTBI 和 RB 存在下，ABDA 在 378 nm 处的吸收分别急剧下降，表明它们能够通过 II 型光化学途径生成 ¹O₂。与未照射相比，在 TPETTI（140.3 倍）和 TPETTBI（423.5 倍）存在下，DHR123 在 526 nm 处的发射强度分别大幅增加。相比之下，MTPAI 组的发射强度变化微弱且可忽略不计。结果表明，TPETTI 和 TPETTBI 可有效生成 I 型和 II 型 ROS，且总体 ROS 生成能力优于 RB 和 Ce6。
线粒体靶向成像
在确认 TPETTBI 优异的光物理性质后，我们进一步在细胞水平研究了其成像能力。使用商业探针，包括 Dio（膜探针）、LysTracker Green（LTG）和 Mito-Tracker Green（MTG），来研究 TPETTBI 的细胞定位。MTG 的绿色荧光信号与 TPETTBI 的红色荧光显示出大量重叠，而 TPETTBI 的红色荧光信号与 LTG 和 Dio 的信号均不重叠。这些结果证明了 TPETTBI 优异的线粒体靶向能力，这可归因于其两性离子结构。此外，由于线粒体是肿瘤治疗的有希望靶点，TPETTBI 的线粒体靶向能力可能潜在地增强其光疗效率。TPETTBI 能够在 10 分钟内可视化线粒体，并且荧光强度随着孵育时间的增加而逐渐增加。值得注意的是，在整个过程中，背景信号可忽略不计，无需洗涤。即使在连续成像 3 小时后，荧光信号也没有衰减，证明了 TPETTBI 优异的光稳定性。这种超快和免洗的染色能力可归因于 TPETTBI 的两亲性和 AIE 性质。一方面，TPETTBI 的亲脂性部分使其易于被细胞摄取。另一方面，带正电的部分使 TPETTBI 能够积累在带负电的线粒体中。此外，TPETTBI 在线粒体中聚集后荧光强度急剧增加，这可以通过 AIE 过程中的分子内运动限制（RIM）机制来解释。
体外杀瘤评估
鉴于 TPETTBI 优异的光动力和光热疗效，以及出色的线粒体靶向能力，我们进一步评估了其光疗性能。首先，使用 CCK-8 法评估了 TPETTBI 的暗毒性和光毒性。即使与 30 μM 的 TPETTBI 孵育，3T3 和 LO2 细胞的存活率仍保持在 90% 以上，表明其暗毒性可忽略且生物相容性良好。照射后，在低至 2 μM 的浓度下，4T1 肿瘤细胞的存活率降至 40%。此外，使用 DCFH-DA 评估了细胞内 ROS 的生成。与其他处理组相比，TPETTBI 和 660 nm 激光照射组中观察到 DCF 强烈的绿色荧光信号，表明细胞内产生了过量的 ROS。随后，进行活 / 死细胞染色以验证 TPETTBI 的光毒性。TPETTBI 和 660 nm 激光处理组显示出强烈的红色信号，仅观察到少量绿色信号，而其他组主要显示绿色信号。此外，通过流式细胞术（FCM）评估了不同处理组的细胞凋亡率。值得注意的是，TPETTBI 和激光处理组的凋亡率增加至 82.8%，而其他组的凋亡率保持在 5% 以下，验证了 TPETTBI 的低暗毒性和良好的治疗效果。
细胞免疫原性细胞死亡诱导研究
鉴于 TPETTBI 出色的线粒体靶向能力和治疗效果，我们进一步利用 JC-1 染色实验研究了其对线粒体的影响。JC-1 染料通常用于监测线粒体膜电位（MMP）的变化，在细胞内通常以两种形式存在。在 MMP 较高的细胞中，JC-1 发出强烈的红色荧光；相反，MMP 降低会导致 JC-1 单体形成，荧光从红色转变为绿色，从而指示 MMP 的变化。TPETTBI 和激光处理组显示出微弱的红色荧光和较强的绿色荧光，合并图像中呈现绿色荧光；相比之下，其他组主要显示强烈的红色荧光信号。我们进行了免疫荧光染色，分析不同处理条件下细胞中 HMGB1 和 ecto-CRT 的表达水平。TPETTBI 和激光处理组中几乎观察不到 HMGB1，表明 HMGB1 发生了迁移和释放。在 ecto-CRT 的免疫荧光染色中，TPETTBI 和激光处理组的细胞表面显示出强烈的 ecto-CRT 红色荧光信号，表明有效诱导了 ICD。这些观察结果表明，TPETTBI 可有效促进 DAMPs 的生成和释放，为 PDT 和 PTT 协同效应引起的 ICD 发生提供了典型证据。
体内近红外 II 区荧光成像
在体外实验取得积极结果的鼓舞下，我们进一步评估了 TPETTBI 的体内性能。首先将 TPETTBI 用 DSPE-PEG2000 包裹，制备得到粒径为 147.8 nm、zeta 电位为 - 20.16 mV 的 TPETTBI 纳米颗粒，这些性质表明其在生物环境中具有良好的稳定性。随后，在 4T1 乳腺癌荷瘤小鼠模型中首次进行了体内肿瘤成像。在静脉注射 TPETTBI 之前，通过 1050 nm 长通（LP）滤光片观察到小鼠的荧光信号较低，表明背景干扰最小。注射后 6 小时，NIR 相机可捕捉到肿瘤部位的 NIR-II 荧光信号，这表明由于增强的通透性和滞留（EPR）效应，TPETTBI 成功在肿瘤组织中积累。肿瘤部位的荧光信号逐渐增强，在注射后 12 小时达到最大值，随后由于代谢而开始衰减。此外，注射后 36 小时对肿瘤组织进行的离体荧光分析证实了 TPETTBI 的有效积累。
体内肿瘤协同光疗
随后，利用 4T1 荷瘤 BALB/c 小鼠模型评估了 TPETTBI 的体内抗肿瘤特性。具体而言，将 4T1 荷瘤小鼠随机分为四组：两组分别接受生理盐水处理（伴或不伴激光照射）的对照组、一组仅接受 TPETTBI 处理的对照组，以及一组接受 TPETTBI 处理后在注射后 12 小时用 660 nm 激光照射的实验组。到 14 天治疗期结束时，三个对照组的肿瘤体积迅速增大，而 TPETTBI 联合激光照射组的肿瘤体积显著减小。同时，治疗结束时 TPETTBI 联合激光照射组的肿瘤重量也显著降低，表明在小鼠模型中光触发的抗肿瘤效果显著。通过苏木精 - 伊红（H&E）染色、末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记（TUNEL）染色和 Ki67 免疫荧光染色，进一步证实了 PDT 和 PTT 联合作用导致的肿瘤组织广泛破坏和细胞增殖抑制。此外，光疗实验中主要器官的 H&E 染色显示无病理损伤，进一步证实了 TPETTBI 优异的生物安全性。治疗结束时采集眼眶血样本，评估潜在的肝肾功能异常。结果显示实验组与三个对照组之间无显著差异，证实了 TPETTBI 优异的生物相容性。溶血实验结果进一步支持了 TPETTBI 在体内实验中的良好安全性。综上所述，这些结果表明 TPETTBI 可通过 NIR-II 荧光成像引导的 PDT 和 PTT 协同效应，有效抑制肿瘤生长且毒性可忽略。
总结
我们提出了一种新颖的分子设计策略，将聚集诱导发射（AIE）、近红外（NIR）发射、线粒体靶向、高效活性氧（ROS）生成和高光热转换等特性整合到单个分子中，旨在通过诱导大规模免疫原性细胞死亡（ICD）实现肿瘤根除。具体而言，通过合理的分子工程，我们赋予 TPETTBI 扭曲的结构、两亲性和增强的 D-A 强度，使其具备优异的线粒体靶向能力、高效的 ROS 生成和高光热转换效率。体外成像结果证实了 TPETTBI 的线粒体靶向能力和荧光开启特性。体内外抗肿瘤研究均表明，TPETTBI 不仅可作为具有 NIR-II 荧光监测能力的光疗剂，还能作为高效的 ICD 诱导剂。在生物组织透明窗口内，针对特定细胞器的光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT）协同作用，实现了对肿瘤的有效精准根除，并增强了 ICD 诱导效果。
参考文献
Strategically Designed Mitochondria-Targeting AIEgens for Effective Eradication of Primary and Metastatic Tumors via Synergistic Phototherapy and Induced Immunogenic Cell Death,Lin Yang, Jiachang Huang, Yanan Liao, Deping Hu, Yake He, Na Feng, Ryan T. K. Kwok, Jacky W. Y. Lam,* Jing Zhang,* Benzhao He,* and Ben Zhong Tang,Adv. Healthcare Mater. 2025, 14, 2500513,https://doi.org/10.1002/adhm.202500513
