内容提要
本研究通过延长聚甲川链，将黄酮基和色烯基染料进一步推向 SWIR 区域。这组九甲川染料的吸收波长可达1149 nm，发射尾端超过 1500 nm。这些染料是迄今为止在其各自带隙处最亮的有机荧光团。我们使用两种九甲川染料 Chrom9 和 JuloFlav9，进行了双色全 SWIR 多路成像（激发波长为 1060 和 1150 nm；发射收集在特定条件下），提高了使用小分子造影剂进行多色 SWIR 成像时能够达到的深度和分辨率。最后，我们将九甲川染料与其他 SWIR 发射荧光团相结合，在自由活动的小鼠中实现了五色清醒成像。
短波红外荧光团的设计
将近红外聚甲川染料（如美国食品药品监督管理局批准的吲哚菁绿）红移至短波红外区域的方法包括延长聚甲川链或修饰杂环。就前者而言，聚甲川链每延长一个 C₂H₂单元，波长可靠红移约 100 nm。但这种方法在短波红外荧光团中应用较少，因为聚甲川链延长至七个甲川以上（即七甲川染料）时，常会导致电子基态不对称，从而降低造影剂的亮度。Schnermann 及其同事报道了含吲哚的九甲川染料可用于短波红外尾端成像，Jin 及其同事则制备了吲哚菁绿的九甲川和十一甲川衍生物，称为 ICG-C9 和 ICG-C11。其中，ICG-C11 的荧光量子产率（Φ_F）令人印象深刻，但整体亮度中等，这可能是由于聚甲川链延长导致基态不对称，使其摩尔消光系数（ε_max）较低。杂环修饰是另一种互补的红移策略，包括苯并环化、调节杂环电子性质、杂原子交换或添加杂环等。多年来，研究团队通过杂环修饰策略，制备出了用于多路成像的明亮短波红外发射荧光团，这些荧光团采用色烯基（Chrom）和黄酮基（Flav）杂环。
九甲川染料的合成与光物理性质
通过 Vilsmeier-Haack 反应与 S9 反应，再与苯胺缩合，得到庚三烯亚基苯铵高氯酸盐连接体 13。最后，在碱性条件下，将两当量的杂环（9、10、11 或 12）与 13 反应，得到九甲川染料 1-4，产率在 7%-23% 之间。这种聚甲川链断裂现象在五甲川和七甲川花菁染料中也有观察到。较低的产率归因于链断裂生成较短链的聚甲川染料以及纯化困难。这些染料的吸收光谱均显示其最大吸收波长（λ_max,abs）在 1000 nm 以上，最大发射波长（λ_max,em）低至 1188 nm。这四种荧光团在二氯甲烷中的荧光量子产率（Φ_F）为 0.15%-0.5%，其中红移最显著的 4（JuloFlav9）的荧光量子产率最低，这与能隙定律一致。其中三种荧光团：2（JuloChrom9；最大吸收波长 = 1092 nm，荧光量子产率 = 0.31%）、3（Flav9；最大吸收波长 = 1110 nm，荧光量子产率 = 0.19%）和 4（JuloFlav9；最大吸收波长 = 1149 nm，荧光量子产率 = 0.15%），在各自对应的波长下展现出了已报道的最高荧光量子产率。
胶束的制备与表征
我们将疏水性九甲川染料包裹到两亲性聚乙二醇 - 磷脂胶束中。在胶束中，九甲川染料的吸收峰变宽，且观察到聚集现象，尤其在 JuloFlav9 胶束中更为明显。胶束尺寸约为 17nm。这些结果与先前报道的荧光团包裹情况一致，其中黄酮基染料比色烯基染料表现出更强的聚集性。我们通过 MTT 法评估了含 Chrom9 和 JuloFlav9 的胶束在细胞中的毒性。将 A375 细胞与三种浓度的 Chrom9、JuloFlav9 或空白胶束共同培养 24 小时后，检测细胞活力。结果显示，空白胶束培养的细胞活力与 Chrom9 和 JuloFlav9 胶束培养的细胞活力相当，表明其毒性可忽略不计。我们比较了含 Chrom9 和 JuloFlav9 的胶束与含 JuloFlav7 的胶束的光稳定性。用 1060nm 激光照射这些样品 5 分钟，以评估新型九甲川染料的相对光稳定性。所有含染料的胶束具有相似的光稳定性。
Chrom9 的单色成像
在获得理想的胶束表征结果后，我们对小鼠静脉注射了含染料 1（Chrom9）的胶束，并立即使用 1060 nm 激发光采集血管图像。当使用 1300 nm 长通滤光片（1060 nm 激发成像实验的标准配置）时，轻松实现了视频速率成像。使用 1400 nm 长通滤光片成像时，该短波红外亚区域的分辨率提升十分明显，增大放大倍数后这一优势更加突出1 小时后，染料 1（Chrom9）从血管中清除，聚集在肝脏和脾脏中，这一点在 48 小时的离体分析中得到了证实。然而，为了更深入了解 Chrom9 在体内肝脏中的留存时间，我们进行了纵向成像。1 天后，观察到 Chrom9 向肝脏和脾脏迁移。4 天后，信号显著减弱，8 天时几乎无信号。16 天时，解剖器官后几乎检测不到信号，无法进行完整的离体分析。这种信号消失可能是由于清除或降解导致，而在基于荧光的清除研究中无法区分这两种情况。结合胶束稳定性研究，很可能在 1 周时降解已较为显著，这些探针仅适用于约 48 小时内的成像。
多通道成像实验
JuloFlav9 染料与 1150 nm 激光的结合，为两项新的多通道成像实验创造了可能：一是在 1500 nm 以上的高分辨率、高穿透深度短波红外亚区域实现全短波红外双通道成像；二是利用生物相容性探针在麻醉和清醒动物中实现五通道成像。我们证实，胶束化的 Chrom9 和 JuloFlav9 可通过 1060 nm 和 1150 nm 激发光进行激发多通道成像。经优化后发现，使用 15 nmol 的染料 1（Chrom9）和 10 nmol 的染料 4（JuloFlav9），在 1500 nm 长通滤光片下，可分别通过 1060 nm 和 1150 nm 激发获得良好信号，且串扰极小。基于这些低串扰条件，我们完成了首次使用生物相容性造影剂的全短波红外多通道成像实验。我们向小鼠腹腔注射染料 4（JuloFlav9），在 20 ms 曝光时间和 1500 nm 长通滤光片下获得了清晰信号。随后，向同一只小鼠静脉注射染料 1（Chrom9），通过激发多通道双色成像，在短波红外高分辨率区域同时可视化血管和腹腔。
1150 nm 激光的引入还使多通道成像拓展至五通道。通过将 786、890、974 nm 激光与全短波红外双色成像中使用的 1060、1150 nm 激光相结合，我们实现了五通道在体成像。此前，我们已开发出两种可分别被 786 nm 和 890 nm 激光优先激发的荧光团（JuloChrom5 和 Chrom5）；对于 974 nm 激光，新合成的类似物 6（LJuloChrom7）和 7（LFlav7）可提供足够的激发重叠。通过优化荧光团浓度、曝光时间和激光功率，我们在毛细管实验中实现了各荧光团在对应波长下的优先激发。随后在小鼠体模中进行的五通道成像实验难度更高，因光散射导致信号减弱。借鉴五通道毛细管和体模实验的经验，我们设计了在体实验以拓展动态多通道成像能力。我们在小鼠背部不同位置皮下注射四种染料（1.1 nmol JuloChrom5、1.2 nmol Chrom5、0.7 nmol LJuloChrom7、0.8 nmol JuloFlav9），并静脉注射 7.8 nmol Chrom9。对麻醉小鼠的五通道成像显示，每个通道均清晰可辨，单通道曝光时间为 10-22 ms。通过基于毛细管成像确定的串扰系数进行线性解混，成功分离了所有通道，尽管 974 nm 和 1060 nm 通道间仍存在少量串扰。我们发现，拓展多通道成像时，平衡中间通道的串扰颇具挑战 —— 延长曝光时间会增加长波长通道的串扰，而提高浓度则会增强高能波长的激发干扰。尽管存在轻微串扰，我们仍首次成功使用全小分子探针完成了五通道无创光学成像实验。
结论
本研究开发了红移的九甲川色烯基和黄酮基荧光团，它们在各自的能带间隙处具有足够的亮度。荧光团 1（Chrom9）在 1400 nm 以上具有明亮的发射。该系列中红移最大的染料 4（JuloFlav9）可在 1150 nm 激发下进行成像。通过将 1150 nm 激光整合到激发多通道成像系统中，我们首次使用小分子造影剂实现了基于 Chrom9 和 JuloFlav9 的双通道短波红外激发多通道成像。值得注意的是，这些红移的荧光团能够在 1500 nm 长通滤光片下进行采集，从而充分利用短波红外的优势（高分辨率、更大深度、多通道）。最后，借助在五个不同激光线下匹配良好的足够明亮的染料，我们成功实现了具有视频帧率的实时五通道在体清醒成像。Chrom9 和 JuloFlav9 支架是向短波红外区域更深处探索的优良核心荧光团。
参考文献
High-Resolution Multicolor Shortwave Infrared Dynamic In Vivo Imaging with Chromenylium Nonamethine Dyes,Anthony L. Spearman, Eric Y. Lin, Emily B. Mobley, Andriy Chmyrov, Bernardo A. Arus, Daniel W. Turner, Cesar A. Garcia, Kyle Bui, Christopher Rowlands, Oliver T. Bruns, and Ellen M. Sletten*,J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 17384−17393,https://doi.org/10.1021/jacs.5c03673
