内容提要
我们合成并鉴定了一种近红外（NIR）荧光且 pH 响应的聚集诱导发射（AIE）光敏剂 DHTPA，用于增强针对细菌感染的光动力治疗。由于其 pH 依赖性的电子结构调控，DHTPA 聚集体在弱酸性条件（pH 5.5）下的活性氧（ROS）生成量比中性条件（pH 7.4）高 2.1 倍。在近红外光照射下，DHTPA 聚集体能精准响应酸性微环境，显著促进 ROS 生成，从而高效清除细菌。DHTPA 对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的杀菌效率均超过 99.9%。在小鼠感染伤口模型中，DHTPA 治疗使伤口愈合速度加快 2.4 倍，显著降低了细菌负荷并减轻了炎症反应，凸显了其治疗潜力。
实验结果与讨论
我们以苯并 [c,d] 吲哚为核心受体单元（A），并结合三苯胺和咔唑衍生物作为强供体单元（D），设计并合成了一系列具有近红外吸收特性的供体 - 受体（D-A）有机小分子（DHCZS、DHCZV、DTPA 和 DHTPA）。苯并 [c,d] 吲哚作为关键中间体，通过两步反应制备而成。作为末端受体单元，苯并 [c,d] 吲哚表现出显著的吸电子特性，使其成为菁染料的通用结构单元。利用各种三苯胺和咔唑衍生物作为供体，通过 Knoevenagel 缩合反应成功构建了目标化合物。在 DMSO 溶液（10 μM）中，紫外 - 可见吸收光谱显示，随着结构的变化，吸收峰逐渐红移，其中 DHTPA 的最大吸收和发射峰分别约为 680 nm 和 730 nm。发射光谱位于近红外 I 区（650-900 nm），在此区域近红外光具有优异的组织穿透能力、低自发荧光、高成像对比度和安全性，有利于生物医学应用。此外，这些分子还表现出 AIE 特性。尽管在纯 DMSO 中荧光微弱，但在混合溶剂中随着甲苯的加入，其荧光强度显著增加。
通过 2,7 - 二氯二氢荧光素（DCFH）在 660 nm 激光照射（0.5 W/cm²）下评估了这些 PS 的 ROS 生成能力。525 nm 处的荧光强度随照射时间显著增加，其中 DHTPA 在这些化合物中表现出最高的 ROS 生成量。进一步使用二氢罗丹明 123（DHR123）检测超氧阴离子（O₂⁻・）、羟基苯基荧光素（HPF）检测羟基自由基（・OH）和单线态氧（¹O₂）传感器绿色（SOSG）检测 ¹O₂，对生成的 ROS 类型进行了鉴定。结果表明，这些 PS 通过 I 型和 II 型光化学途径产生多种 ROS，使其在常氧和缺氧条件下均能实现强大的治疗效果。其中，DHTPA 聚集体表现出最显著的 ROS 生成能力。
为了探索 “明星分子” DHTPA 的酸响应特性，采用紫外 - 可见 - 近红外光谱研究了其在不同 pH 缓冲液中的吸收和发射行为。当 pH 从 3.0 升至 10.0 时，635 nm 处的吸光度显著增加，表明其具有明显的 pH 响应吸收特性。通过高分辨率质谱进一步确认了 DHTPA 质子化前后的分子结构。pH 10 时 DHTPA 的质谱峰为 513.21808，与提出的结构高度吻合。此外，计算得出 DHTPA 中性形式的 HOMO-LUMO 带隙为 3.726 eV，质子化后降至 1.968 eV。能隙的大幅减小表明质子化显著增强了分子的电子接受能力，从而促进了更强的分子内电荷转移（CT）特性。因此，随着 pH 降低，CT 吸收带显著增强。此外，我们评估了 DHTPA 聚集体在 pH 7.4（7.68 μs）和 pH 5.5（11.76 μs）时的磷光寿命。在弱酸性条件下观察到的更长磷光寿命进一步证实了酸性条件下 ROS 生成的增强。对于靶向 pH 值在 4.5 至 6.5 之间的细菌感染区域的理想 PS，pKa 值接近该范围至关重要。这确保了光敏剂在感染区域的质子化状态最大化光动力反应的效率。在本研究中，其他三种 PS 的 pKa 值分别为 7.30、8.83 和 7.08，均显著高于 DHTPA 聚集体的 pKa 值。因此，DHTPA 是最适合抗菌治疗的目标光敏剂。通过曲线拟合确定 pKa 值为 6.70。还测试了 DHTPA 聚集体在典型 pH 条件下的 ROS 生成情况，以评估其作为用于 PDT 的智能酸响应光敏剂的潜力。在 660 nm 激光照射下，DHTPA 聚集体在 pH 5.5 时的 ROS 生成显著增强。DCFH 的荧光强度在 120 秒后增加了近 26 倍，而在 pH 7.4 时仅增加约 14 倍。这表明 DHTPA 聚集体的光敏性能在酸性条件下显著增强，能够高效生成 ROS。这些结果明确证明 DHTPA 是一种高效的酸响应光敏剂，能够在酸性环境中增强 ROS 生成，从而实现优异的 PDT 疗效。这种环境响应性不仅拓宽了 DHTPA 在治疗与酸性微环境相关疾病（如细菌感染）中的治疗潜力，还为设计更高效的 PS 提供了有价值的见解。
鉴于 DHTPA 聚集体卓越的 ROS 生成能力，本研究进一步探究了其在不同 pH 条件下的抗菌性能及潜在机制。选择金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的代表。实验分为四组：对照组、对照组 + L（660 nm 激光照射）、DHTPA 组和 DHTPA+L 组（其中 “L” 表示 660 nm 激光照射）。在酸性（pH=5.5）和中性（pH=7.4）条件下，与其他组相比，DHTPA+L 组的细菌生物膜 CFU 数均显著减少，且酸性条件下的抗菌效果更为明显。具体而言，在 pH=5.5 时，金黄色葡萄球菌生物膜的 CFU 数减少了约 4 个对数单位，大肠杆菌生物膜的 CFU 数减少了约 3 个对数单位。在 DHTPA 组中，在无光条件下，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的 CFU 数均减少了 1 个对数单位。这可能是由于在酸性环境中，带正电荷的 DHTPA 聚集体与细菌细胞膜上带负电荷的磷酸基团相互作用，DHTPA 的疏水片段与细菌脂质膜之间的疏水相互作用最终导致膜破坏和细胞内容物泄漏，从而引起细菌细胞死亡。然而，观察到的抗菌效果仅导致 CFU 数减少 1 个对数单位，对应约 90% 的杀菌率。这表明抗菌效果仍不够理想，因为剩余的 10% 细菌可快速增殖，可能导致治疗失败。通过利用 DHTPA 聚集体的 PDT 效应，可产生大量 ROS，通过双重作用机制增强细菌清除效果。相比之下，在 pH=7.4 时，抗菌效果相对较弱，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜的 CFU 数分别仅减少约 2 个和 1 个对数单位。
为了进一步研究 DHTPA 聚集体对生物膜的影响，本研究利用荧光染料结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行 3D 重建分析。在该分析中，红色荧光表示细菌细胞死亡，绿色荧光表示活细胞。展示了不同处理条件下金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜的荧光图像。结果显示，在对照组中，鲜艳的绿色荧光表明金黄色葡萄球菌生物膜结构完整。相比之下，在酸性条件下的 DHTPA+L 组中，占主导的红色荧光表明细菌细胞广泛死亡。与对照组和 DHTPA 组相比，DHTPA+L 处理导致金黄色葡萄球菌生物膜中的红色荧光强度显著增强，在 pH 5.5 和 pH 7.4 时的活 / 死细胞比率分别约为 7% 和 17%。此外，DHTPA+L 组显著降低了生物膜厚度，形成了更薄且更具渗透性的生物膜，在 pH 5.5 和 pH 7.4 时的厚度分别为 16 µm 和 28 µm。
为了研究不同处理条件下细菌生物膜内的 ROS 水平变化，使用 2',7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为荧光探针对 ROS 进行染色。对照组和对照组 + L 组均几乎无绿色荧光信号，而 DHTPA 组的生物膜呈现微弱的绿色荧光。这可能是由于静电相互作用促进了小分子 DHTPA 渗透进入细菌细胞。相比之下，DHTPA+L 组的荧光强度显著增加，表明在 PDT 处理下生物膜内 ROS 生成量显著升高。ROS 的积累破坏了细菌细胞膜的完整性，并干扰了重要的生理过程，最终导致细菌细胞死亡。这些发现突显了 DHTPA 聚集体在针对生物膜的光响应抗菌应用中的巨大潜力。
为了进一步研究 DHTPA 聚集体在对抗伤口感染中的功效，我们使用金黄色葡萄球菌感染的皮肤伤口愈合小鼠模型进行了体内研究。将伤口分为四组：对照组、对照组 + L 组（660 nm 激光照射）、DHTPA 组和 DHTPA+L 组。展示了体内抗菌实验的工作流程。展示了在预定时间点（第 0、2、4、6、8 和 16 天）的伤口照片、伤口闭合数据和定量分析。与对照组相比，DHTPA 组的伤口尺寸显著减小，愈合程度中等。细菌感染引起的持续性炎症通常会阻碍和延迟愈合过程。在第 16 天，DHTPA+L 处理的伤口闭合情况显著增强，表现优于所有其他组。这种优异的表现可归因于 DHTPA 在不同 pH 条件下卓越的 ROS 释放能力，从而促进伤口愈合。通过 CFU 计数进一步评估不同组的抗菌效果，以确定伤口区域的活菌数量。DHTPA+L 组的细菌数量显著减少了约三个数量级，超过了其他组的表现。这一结果表明，DHTPA 聚集体在 660 nm 激光照射下可有效根除金黄色葡萄球菌。然而，体内抗菌效果略低于体外观察到的效果，这可能是由于体内感染的微环境复杂，为细菌提供了生存和增殖所需的营养物质。
为了进一步评估 DHTPA 聚集体在修复感染伤口中的作用，使用苏木精 - 伊红（H&E）染色和 Masson 三色染色对伤口组织进行了组织学评估。感染伤口的典型特征是炎症细胞的显著浸润，而炎症细胞数量的定量分析如图所示。在第 16 天，对照组的伤口表现出广泛的免疫细胞浸润，表明细菌感染引发了急性炎症反应，延迟了愈合过程。相比之下，DHTPA+L 组的炎症细胞浸润明显减少，表明炎症得到缓解。炎症的减少可归因于 DHTPA 聚集体在 660 nm 激光照射下产生的强大 ROS，这增强了其抗菌效力并加速了伤口修复。Masson 三色染色用于评估胶原纤维再生，这是伤口愈合过程中组织修复的关键指标 。图展示了第 16 天不同治疗方案处理的伤口中的胶原沉积情况。与其他组相比，DHTPA+L 组的胶原沉积显著增加，分布更加连续和突出，定量分析也证实了这一点。这些发现表明，DHTPA 聚集体与激光照射相结合，通过减轻炎症反应和促进金黄色葡萄球菌感染伤口中的胶原沉积，有效促进伤口愈合。DHTPA 聚集体在光照射下能有效响应细菌感染的酸性微环境，清除病原体并减轻炎症，从而使伤口从炎症期过渡到增殖期和重塑期。这一机制加速了感染伤口的愈合。此外，通过 24 小时 CCK-8 试验评估了 DHTPA 聚集体的生物相容性。在浓度为 50 μg/mL 时，细胞存活率降至 85.5%，这被认为是后续实验的相对安全阈值。溶血试验进一步证实了 DHTPA 聚集体具有良好的生物相容性。H&E 组织学分析显示，给予 DHTPA 聚集体后，主要器官未出现炎症或异常变化。通过分析小鼠的血液生化标志物和血常规参数，评估了 AIEgens 的体内毒性，旨在评估 DHTPA 聚集体在 PDT 中的生物安全性。实验组和对照组的血常规参数或生化标志物均未观察到显著差异（p > 0.05）。在 DHTPA 聚集体处理后 1、4 和 24 小时，在感染金黄色葡萄球菌的切除伤口中检测到强荧光信号，而在感染金黄色葡萄球菌小鼠的主要器官中未观察到荧光。这些发现表明，DHTPA 聚集体在伤口部位具有较强的滞留性，组织渗透性有限，且避免了在主要器官中的积累。同样，在未感染的小鼠中，给予 DHTPA 聚集体后，主要器官中也未检测到荧光信号。此外，肝脏被确定为静脉注射后 DHTPA 聚集体代谢的主要器官。DHTPA 聚集体在 24 小时内完全生物降解，表明不存在长期毒性。这些结果表明，DHTPA 聚集体在 50 μg/mL 的浓度下表现出良好的生物安全性，在体内应用中具有显著潜力。
总结
我们精心设计并鉴定了一种近红外（NIR）光敏剂 DHTPA，其整合了酸响应性和聚集诱导发射（AIE）特性。这种光敏剂在酸性条件下可显著增强活性氧（ROS）生成，并在近红外光激活下于细菌感染组织中实现高效的光动力治疗（PDT）。DHTPA 聚集体克服了传统 PDT 在复杂生物环境中的局限性，在治疗伤口感染方面展现出卓越潜力。它能有效清除细菌、降低毒力因子表达、减轻组织炎症、促进胶原沉积并刺激血管生成，从而加速感染伤口的愈合。在抗生素耐药性日益严峻的背景下，这种双重响应型 AIE 光敏剂为抗菌治疗提供了创新的替代策略，并为未来的临床转化提供了有力支持。
参考文献
pH-Responsive AIE Photosensitizers for Enhanced Antibacterial Therapy,Qihang Ding, Lina Ding, Chunbai Xiang, Chunbin Li, Eunji Kim, Changyu Yoon, Haoran Wang, Meijia Gu, Pengfei Zhang, Lin Wang,* Ben Zhong Tang,* and Jong Seung Kim*,Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e202506505,https://doi.org/10.1002/anie.202506505
