内容提要
通过将硒取代的苯并吩噻嗪光敏剂与吡唑啉酮基团结合，开发了一种膜锚定光动力免疫治疗剂 PNBSe，其能够通过吡唑啉酮 - 蛋白质相互作用实现膜靶向。在光照射下，PNBSe 诱导快速且强烈的细胞坏死，导致细胞膜破裂、细胞器肿胀和内容物泄漏。PNBSe 激活炎症信号通路，诱导免疫原性细胞死亡，并重塑免疫抑制性肿瘤微环境，最终在体内促进系统性抗肿瘤免疫反应。
实验结果与讨论
PNBSe 的制备是通过硒取代的苯并吩噻嗪光敏剂（NBSe-NH2）与吡唑啉酮基团之间的酰胺反应实现的，该过程既简单又高效。PNBSe 在 660nm 处有最大吸收，在 700nm 处有荧光发射。PNBSe 的近红外（NIR）吸收和发射特性使其非常适合生物应用，因为近红外光可最大限度减少组织中的自发荧光和光毒性，从而实现更深的肿瘤穿透，同时减少衰减并提高安全性。重要的是，与 NBSe-NH2 相比，与吡唑啉酮基团的结合不会改变 PNBSe 的光谱性质。同样，NBSe-NH2 和 PNBSe 之间光敏剂的静电势保持不变，表明结合不会影响光敏剂的光物理特性。
为了验证 PNBSe 的细胞膜锚定能力，选择了三种癌细胞进行荧光成像，包括小鼠乳腺癌细胞（4T1）、人乳腺癌细胞（MCF-7）和人肝癌细胞（HepG2）。用 PNBSe 孵育的细胞与商用膜染料 DiO 表现出优异的共定位。此外，PNBSe 与细胞膜的结合稳定超过 48 小时，但商用染料的表现不尽如人意，因为 DiO 在数小时内就会渗入细胞。相比之下，与细胞孵育的 NBSe-NH2 分子显示出明亮的细胞内荧光信号。PNBSe 的细胞膜锚定能力归因于吡唑啉酮基团与氨基酸（AAs）之间的相互作用，使其能够与膜蛋白结合。
使用荧光指示剂 DCFH-DA 评估了 PNBSe 在细胞水平下光照时的活性氧（ROS）生成情况。用 DCFH-DA 和 NBSe-NH₂(L) 处理的细胞显示出明亮的细胞内绿色荧光信号，而 PNBSe (L) 组在光照后细胞内未观察到明显的 ROS 荧光信号。然而，PNBSe (L) 组的细胞在光照下会发生变形并逐渐死亡，明亮的绿色荧光定位于细胞边缘。这些发现表明，PNBSe 由于其稳定的膜锚定能力而不会穿透细胞，但其在细胞膜中高效生成的 ROS 可促进快速的细胞杀伤。用 4T1、HepG2 和 MCF-7 细胞进行细胞活力测定，研究 PNBSe 的光疗效果。正如预期的那样，PNBSe 介导的光疗（660 nm，20 mW/cm²，5 分钟）诱导了大量的肿瘤细胞破坏，4T1 细胞的半最大抑制浓度（IC₅₀）为 0.2 μM。此外，即使在无光照射的情况下，随着 PNBSe 浓度的增加，孵育 24 小时后超过 90% 的细胞仍保持存活，证实了其在体外的良好生物相容性。使用 Calcein-AM/PI 试剂盒进行活 / 死细胞成像。具体而言，Calcein-AM 可水解为极性分子 Calcein，其在活细胞中发出绿色荧光，并由于其强负电荷而保留在细胞内。相反，PI 可通过与 DNA 双螺旋结合来染色死亡细胞，并产生红色荧光。结果进一步证实了 PNBSe 的高生物相容性和强大的细胞杀伤效率。光照后细胞中观察到的形态学变化与细胞凋亡相关的形态学变化显著不同。使用 Calcein-AM/PI 试剂盒对细胞进行染色，以监测细胞内和膜通透性的变化。PDT 处理后细胞迅速肿胀，膜完整性丧失，细胞内容物泄漏，这从绿色荧光的扩散中可以明显看出。在 30 分钟内观察到完全的细胞死亡，伴随着来自 PI 染色细胞核的明亮红色荧光。值得一提的是，当细胞在光照后肿胀破裂时，细胞膜上 PNBSe 的红色荧光也会碎裂，这也表明细胞膜完整性的丧失。
为了确定 PNBSe 介导的细胞坏死是否能诱导强烈的免疫原性细胞死亡（ICD），在细胞死亡后监测了损伤相关分子模式（DAMPs）的释放。钙网蛋白（CRT）是一种促凋亡蛋白，在 ICD 过程中可转移到细胞膜表面，作为 “吃掉我” 信号来刺激抗肿瘤免疫反应。在 PNBSe (L) 组中检测到明显的 CRT 阳性信号，流式细胞术分析进一步证实了相同的结果。同时，高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）从细胞核释放到细胞外空间是 ICD 的另一个标志。免疫荧光分析显示，PNBSe (L) 组的细胞核中绿色荧光可忽略不计，表明肿瘤细胞中 HMGB1 显著泄漏。此外，细胞外 ATP 水平的升高被认为是一种 “找到我” 信号，有助于招募和激活抗原呈递细胞（APCs）以促进细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）极化。PNBSe (L) 组的 ATP 分泌水平显著增加。这些发现一致表明，PNBSe 在光照下通过释放丰富的 DAMPs 诱导肿瘤细胞发生 ICD，从而潜在地启动免疫反应。在坏死过程中，细胞内容物的释放通常会触发炎症反应，这可能通过促进 M1 巨噬细胞极化来激活先天免疫。为了研究这一机制，建立了一个 Transwell 系统，将各种处理过的 4T1 细胞与 RAW 264.7 巨噬细胞共培养，旨在评估炎症细胞因子的释放和巨噬细胞极化。结果显示，PNBSe (L) 组的炎症细胞因子分泌水平显著升高，并且 M1 极化明显，从而证实了体外先天免疫的激活。此外，使用由骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）和 4T1 细胞组成的 Transwell 模型来评估各种处理后的树突状细胞（DC）成熟情况。定量流式细胞术分析表明，与对照组相比，PNBSe (L) 处理导致大量 DC 成熟（CD86⁺CD80⁺，42.9%）。这些结果验证了 PNBSe 在光照下诱导的细胞坏死在体外有效地触发了免疫反应。
体外实验的 promising 结果促使我们探索 PNBSe 在体内抗肿瘤应用中的潜力，并评估 PNBSe (L) 诱导的 robust 抗肿瘤免疫反应是否能对未治疗的远端肿瘤产生远隔抑制效应。我们建立了双侧 4T1 荷瘤小鼠模型，以评估 PNBSe 的光疗和免疫治疗效果。将小鼠分为三组，对原发性肿瘤进行不同处理。用 PBS 或单独 PNBSe 处理的对照组显示原发性肿瘤快速生长，16 天后体积分别增加了 6.5 倍和 6.1 倍。相比之下，PNBSe (L) 组有效抑制了原发性肿瘤的生长，肿瘤抑制率达到 97.8%。原发性肿瘤组织的组织学染色证实，治疗后 PNBSe (L) 组出现明显损伤，而对照组未观察到实质性损伤。类似地，PBS 组和 PNBSe 组的远端肿瘤生长迅速，而 PNBSe (L) 组表现出强烈的远隔效应，肿瘤抑制率为 94.2%，这可能归因于 PNBSe 在光照下诱导的抗肿瘤免疫反应。16 天后的肿瘤重量和形态分析进一步证实了对原发性和远端肿瘤的有效抑制。
为了进一步验证 PNBSe 介导的快速膜破裂和细胞坏死在体内诱导的免疫激活，在不同处理后的第三天进行了免疫学分析。使用流式细胞术分析不同组的肿瘤组织，以评估 M1 巨噬细胞（CD86⁺F4/80⁺）的表达。分析显示，肿瘤组织内 M1 巨噬细胞从 9.1% 显著增加到 31.1%，而 M2 巨噬细胞相应地从 56.6% 减少到 25.6%，表明 PNBSe 介导的治疗有效地将肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）重编程为 M1 表型，从而激活先天免疫。同时，使用从治疗组收集的血清通过 ELISA 定量肿瘤中的细胞因子水平（TNF-α、IFN-β、IL-6 和 IL-1）。与其他组相比，用 PNBSe (L) 处理的小鼠表现出显著更高的细胞因子水平，证实了体内抗肿瘤先天免疫反应的成功激活。
结论
PNBSe 分子是通过将硒取代的苯并吩噻嗪（NBSe-NH₂）与吡唑啉酮基团结合而设计的，该设计通过吡唑啉酮 - 蛋白质相互作用赋予了光敏剂精确且稳定的细胞膜锚定能力。在光照射下，PNBSe 会产生足够的活性氧（ROS），通过氧化作用诱导直接的细胞膜破裂，导致快速且强烈的细胞坏死。这种坏死会导致细胞内容物释放，引发促炎反应，并促进巨噬细胞向 M1 型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）表型极化，从而激活先天免疫。细胞坏死后释放的肿瘤相关抗原和损伤相关分子模式（DAMPs）有助于树突状细胞（DC）的成熟和迁移，募集细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）以产生适应性免疫，这对癌症免疫治疗中的抗肿瘤反应至关重要。最终，PNBSe 通过实现双侧肿瘤抑制和防止肿瘤转移，展现出了令人满意的光动力免疫治疗效果。
参考文献
Pyrazolone-Modified Photosensitizers for Precise Cell Membrane Rupture to Enhance Cancer Immunotherapy,Yingchao Chen, Tao Xiong, Mingrui Gu, Mingle Li, Xiaoqiang Chen,* Lei Wang, Jiangli Fan,* and Xiaojun Peng,J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 17915−17925,https://doi.org/10.1021/jacs.5c02764
