内容提要
量身定制的光物理特性和化学活性是功能性染料在体内生物医学治疗中的终极追求。本文报道了七甲基菁的吸收波长和荧光发射波长的独立调控。这些染料保留近红外荧光发射(除氮改性染料外)，同时具有从590到860纳米不等的可变吸收波长。这使我们能够获得定制的功能性染料，满足组织光学特性定义的激发和荧光波长要求，用于体内生物医学应用。通常使用硝基改性光热活性衍生物Cy-Mu-7-9，其在810 nm的PBS波段具有很强的吸收，该波长平衡了组织穿透深度和非特异性光热效应，通过光热诱导小肠上皮细胞上调热休克蛋白70来实现非破坏性炎症性肠病(IBD)的治疗。相应的氨基修饰染料Cy-Mu-7-9- NH2, Cy-Mu-7-9- 9经口服后可在健康肠道内形成，是一种荧光化合物，在PBS中发射800nm。基于Cy-Mu-7-9和Cy-Mu-7-9- nh2对IBD的敏感转化，首次通过荧光成像与光热治疗的协同作用实现体内IBD的治疗和治疗效果评价。
结果与讨论
不对称Cy-7的合成与光物理性质
采用逐步缩合反应将吲哚和吡啶通过聚甲基链连接。它们不同的修饰位点支持了不对称菁胺与二烷基胺、氨基、甲基、溴原子和硝基的化学修饰以调整其振动结构。我们分别在DCM、DMSO和PBS中评价了Cy-Mu-7衍生物的光物理性质。DCM作为低极性的非质子溶剂，在一定程度上避免了氢键、黏度和溶剂笼对染料光学性能的干扰。在DCM中，Cy-Mu-7系列染料的最大吸收峰(abs)在590 nm到860 nm之间变化。与传统的对称菁氨酸相比，不对称Cy-Mu-7系列在吸收光谱上呈现出整体的下色偏移，在半最大值处全宽度增加。这些光物理性质的变化主要是由聚甲基骨架上单个原子的正电荷逐渐定位引起的。随着溶剂极性的增加，吸收光谱的下色移加剧。除CyMu-7-9外，其余染料均具有近红外荧光发射。不对称修饰带来100 ~ 200 nm的Stokes位移，明显大于传统对称修饰的Stokes位移，可以提高基于染料的体内荧光成像应用中的信噪比。
体外氧化还原调制荧光和热辐射转化
Cy-Mu-7-9的氨基修饰的七甲基菁及其还原形式，即氨基修饰的Cy-Mu-7-9- nh2，其光物理性质特别吸引人。光致电子转移是硝基修饰荧光团荧光猝灭的常见原因。激发后，电子转移态的完全电荷分离导致振荡强度可以忽略不计，从而限制了辐射跃迁。结果表明，光热效应主要表现为非辐射跃迁，包括内部转换和振动弛豫。Cy-Mu-7-9在PBS中表现出较强的以810 nm为中心的吸收和有效的光热效应。相应的摩尔消光系数为9 × 103 M−1cm−1。此外，在808 nm激光照射下，Cy-Mu-7-9的光热转换效率为28.05%。然而，在Cy-Mu-7-9-NH2情况下则相反。Cy-Mu-7-9-NH2是一种具有430 ~ 700 nm宽吸收范围和800 nm强荧光发射的荧光化合物。Cy-Mu-7-9-NH2在PBS中具有270 nm的超大Stokes位移，这是促进高信噪声体内荧光成像的有效特性。总的来说，这些光物理性质符合生物医学功能染料的光学要求，表明Cy-Mu-7-9和Cy-Mu-7-9-NH2可能是氧化还原相关体内治疗的合适工具。硝基还原酶(Nitroreductase, NTR)是一种以NADH为电子供体将硝基芳香族化合物还原为相应胺的酶，广泛存在于细菌和缺氧组织中。 Cy-Mu-7-9作为NTR的潜在底物在体外进行了评估。如图3B所示，NTR和NADH的存在使含有Cy-Mu-7-9的PBS溶液的荧光增强了约25倍。对比还原溶液与Cy-Mu-7-9- NH2的荧光光谱，我们证实上述体系将Cy-Mu-7-9- NH2转化为Cy-Mu-7-9- NH2。
基于体内荧光成像和光热成像的IBD诊断
为了评估Cy-Mu-7-9在IBD小鼠中的光学外观，我们用葡聚糖硫酸二钠(DSS)溶液喂养模型小鼠。相应的过程如图4E所示。Cy-Mu-7-9给药后，与荧光明显的对照组相反，IBD小鼠腹部完全没有荧光，这与生理盐水给药后的健康小鼠一致。在体内荧光成像的同时，我们还对808 nm激光照射下的小鼠进行了实时热成像。照射4min后，小鼠腹部相应温度趋于稳定。图4G分别为Cy-Mu-7-9给药健康小鼠和IBD小鼠激光照射前后的热成像结果。IBD小鼠的腹部温度升高是正常小鼠的3倍。因此，这些结果验证了我们的推测，即肠道中Cy-Mu-7-9酶转化为Cy-Mu-79-NH2与IBD有关，荧光成像和热成像的互补可用于体内IBD诊断。
体内IBD治疗
考虑到Cy-Mu-7-9在肠道中的炎症响应光热效应，炎症灶的原位光热模拟可能是激活HSP70表达和抑制炎症的有效方案。在DSS喂养的基础上，分别于灌胃后第2、4、6天给予Cy-Mu-7-9，并在灌胃后3.5 h进行光热刺激。为了增加HSP70的表达，同时避免细胞热损伤，根据42℃~ 46℃为中等温度范围，指定相应的激光照射剂量。环孢素A (Cyclosporin A, CsA)是一种钙调神经磷酸酶抑制剂，可防止t细胞亚群克隆扩增，本部分采用环孢素A作为临床干预手段。图中为不同处理小鼠的体重变化。在前7天，与对照组和CsA组的体重逐渐增加不同，DSS组从第3天开始体重明显下降。激光组体重基本不变，主要是在Cy-Mu-7-9给药前禁食所致。经过第8天基于荧光成像的治疗性评价，激光组小鼠的体重在常规喂养的基础上逐渐增加。然而，在接下来的7天里，即使没有摄入DSS, DSS组的小鼠也表现出持续的体重减轻。在实时荧光成像实验中，我们注意到除DSS组外，其余三组小鼠在Cy-Mu-79给药30 min后均表现出较强的荧光信号。同时，激光组IBD小鼠粪便出血情况明显改善。因此，结合疾病活动性指数分析，我们证实Cy-Mu-7-9通过体内光热反应对IBD具有治疗作用。这一结果也得到了组织病理学分析的支持。
总结
Cy-Mu-7-9及其对应的Cy-Mu-7-9- nh2具有可调控荧光和光热转化的特点，在IBD的治疗应用中具有若干优势。首先，它们的光物理性质适合体内荧光成像和生物医学治疗光学窗口，以确保敏感的IBD诊断和有效的光热治疗。其次，CyMu-7-9在酸性胃环境中是惰性的，几乎不能通过肠道吸收。这使得口服给药成为最方便、最可靠的剂型，避免了因肠道吸收时的首过效应导致药物有效浓度降低。实际上，这些特征最大限度地减少了外源性功能染料或药物的全身毒性，这对IBD复发性慢性炎症至关重要。第三，Cy-Mu-7-9在体内首次实现了对肠道炎症部位进行可控热刺激上调HSP70表达的实验。显然，与之前利用等温动物在环境高温应激下调节HSP70的尝试不同，这项工作提供了明确的证据，证明肠上皮细胞中的HSP70是IBD治疗的靶点。Cy-Mu-7-9和Cy-Mu-7-9- nh2在肠道内随消化代谢，随粪便排出体外。在健康小鼠中，染料吸附在消化产物上，导致肠道内分布不均匀，特别是在进入下结肠和直肠后，由于形成粪便。由于腹泻是IBD小鼠的典型和常见症状，因此可能会在一定程度上缓解染料分布不均匀引起的潜在光热刺激不足。此外，考虑到肠道蠕动以消化和粪便排泄为主，多次光热刺激将是提高治疗效果的更好选择。
参考文献
Biomedical-Optical-Window Tailored Cyanines for Steerable Inflammatory Bowel Disease Theranostic Yongkang Yue, Jiahong Ai, Weijie Chi,* Xiaoni Zhao, Fangjun Huo, and Caixia Yin*，Adv. Mater. 2024, 2408450，https://doi.org/10.1002/adma.202408450
