内容提要
荧光寿命成像已成为生物医学研究的有力工具。近年来，基于荧光寿命的多路复用成像通过使用具有相同光谱通道和不同激发态寿命的探针来扩展成像通道。虽然人们希望控制任何给定荧光探针的激发态寿命，但合理控制荧光寿命仍然是一个挑战。本文选择二吡咯甲烷硼(BODIPY)作为模型体系，并提供化学策略来调节其具有不同光谱特征的衍生物的荧光寿命。我们发现在8 '和5 '位置上的结构取代基的电负性对绿发和红发BODIPY支架的寿命有重要的控制作用。在力学上，这种影响分别是通过光诱导的BODIPY的8 '和5 '位置的电子转移和分子内电荷转移过程施加的。基于这些原理，我们已经生成了一组BODIPY探针，使成像实验能够使用荧光寿命作为信号分离多个目标。除了BODIPY外，我们还设想通过化学取代基的电负性调节可以作为一种可行的策略，以实现对各种小分子荧光团的荧光寿命的合理控制。
结果与讨论
光诱导电子转移(PET)合理控制绿色BODIPYs的寿命
由于其优异的量子产率、亮度、光稳定性和生物相容性，BODIPY支架作为荧光探针广泛应用于生物成像领域。光谱调节也通过结构修改实现，将BODIPY的光谱范围扩展到覆盖整个可见光谱和部分近红外光谱。典型的BODIPY染料通过光诱导电子转移(PET)过程来改变辐射效率，主要是通过在苯的第(8)段位置引入具有强电子供体或受体能力的芳基取代。为此，我们合成了一系列不同取代基的绿色BODIPYs。首先，我们安装了一组吸电子基团。硝基(NO2)取代衍生物1由于从荧光团到取代基的强PET，几乎没有荧光(Φ - 0)。有趣的是，当取代基的吸电子能力下降时，得到的BODIPY衍生物的荧光寿命有明显的增加趋势，吡啶基的2荧光寿命为1.48 ns，氰基的3荧光寿命为1.71 ns，三氟甲基的4荧光寿命为2.85 ns，氟的5荧光寿命为3.78 ns。这些结果表明，取代基的吸电子能力越强，非辐射衰变效率越高，PET过程越深入，寿命越短。具有供电子取代基的BODIPY衍生物也得到了类似的观察结果，以二甲基胺为代表的6强给电子基团导致寿命缩短。化合物6中的强给电子基团(NMe2)导致取代基向荧光团产生明显的PET，从而完全猝灭荧光发射(EtOH中Φ=0.002)。随着给电子能力的降低，BODIPY衍生物的荧光寿命呈上升趋势，含吡啶的7荧光寿命为3.04 ns，含羟基的8荧光寿命为3.36 ns，含甲氧基的9荧光寿命为3.49 ns，含甲基的10荧光寿命为3.74 ns。这些结果表明，BODIPY衍生物的寿命可以通过调节苯(8)位取代基的电负性来调节。我们进一步尝试调节第(8)段位置取代基的迁移率，因为取代基和荧光团之间的适当二面角对于有效的PET是必要的。为此，我们在取代基的邻位上安装了位阻。在这种情况下，4-甲基取代化合物10表现出3.74 ns的短寿命。然而，在邻位(13)安装甲基导致荧光寿命延长，为6.17 ns(未取代的11为6.43 ns)。在第(8)段位置上的氟也进行了类似的观察，第(8)段位置为5，其寿命较短，为3.78 ns，或邻位位置为12，其寿命较长，为6.14 ns。综上所述，绿色BODIPY衍生物的荧光寿命可以通过在(8)段位置安装具有不同电负性的取代基或在具有不同空间位阻的取代基的邻位安装来调节PET过程。
ICT控制红色BODIPYs的寿命
为了将基于BODIPY的荧光团的光谱空间扩展到多路成像，我们首先在BODIPY的5位通过苯基扩展π共轭结构，生成发出红色荧光的衍生物，然后根据绿色BODIPY衍生的调控机制在(8)位上安装取代基(化合物S1-S5)。然而，我们观察到调节电负性或位阻的影响可以忽略，这表明PET机制无法调节红色BODIPY衍生物的荧光寿命。作为一种替代策略，我们随后研究了红色BODIPY衍生物的寿命是否会受到BODIPY 5位π共轭结构的电负性的影响。为此，我们加入了具有不同给电子能力(化合物14-20)或吸电子能力(化合物21-27)的杂环，生成了一系列具有红色荧光发射的衍生物。有趣的是，随着杂环吸电子能力的增强，这些化合物的荧光寿命逐渐增加，富电子芳基的寿命值比缺电子芳基短。例如，给电子基团大多是寿命值较短的，如哌替啶基(14,3.25 ns)、咔唑基(15,3.77 ns)、二甲氨基(16,3.79 ns)、吲哚基(17,3.51 ns和18,4.04 ns)和吡啶基(19,4.16 ns)。相比之下，吸电子基团的寿命值更高，分别为苯基(23,5.23 ns)、氯(24,4.92 ns)、三氟甲氧基(25,5.57 ns)、三氟甲基(26,5.07 ns)和氰基(27,5.19 ns)。除了寿命变化外，我们还发现化合物14-27在BODIPY的5位吸电子能力增强时，激发和发射波长有明显的蓝移趋势。例如，富电子的咔唑基的最大发射波长(15,612 nm)比缺电子的三氟甲基(26,561 nm)明显红移。这一观察结果强烈表明，在BODIPY发色团和5位取代基之间存在分子内电荷转移(ICT)过程。为了支持这一观点，对选定的化合物进行了密度泛函理论(DFT)计算，结果显示S1不断增加!供电子容量为16 (2.338 eV)、21 (2.437 eV)、26 (2.477 eV)时，能隙值逐渐减小。相应地，它们的辐射寿命从3.69 ns(16)增加到3.76 ns(21)到3.93 ns(26)。总的来说，红发BODIPY衍生物的结果表明，它们的寿命控制可以通过改变5位取代基的电负性来调节ICT过程来实现。
BODIPY寿命成像
基于BODIPY的探针不仅具有不同的光谱特性，而且具有激发态寿命，这使得我们能够基于光谱通道和荧光寿命的组合进行光谱-时间复用成像。在这种成像模式下，两种或多种具有相似光谱特征的BODIPY衍生物可以通过荧光寿命成像显微镜(FLIM)通过其不同的寿命在显微镜下分离。为此，选择在广泛的生物环境中寿命保持稳定的探针，从而确保通过不同的寿命值分离多个探针标记的靶标是很重要的。因此，我们发现探针的寿命对溶剂极性和粘度不敏感(低斜率c - 0.07)，表明这些探针适合光谱-时间成像。我们首先用体外制备的具有层状结构的蛋白质凝聚体来证明这种应用。弹性蛋白样蛋白(elastin-like proteins, ELP)作为一种已建立的体系，具有VPGXG序列的多个五聚体重复序列，可通过相分离过程形成液体凝聚体。在最近的研究中，发现含有两个或两个以上ELP序列的凝析油呈现层状结构。因此，我们分别用红色发光的BODIPY-NHS酯探针28和29标记了V-120和V5A5-120 ELPs的氨基端，随后用V-120·28或V5A5-120·29形成液态冷凝物。通过FLIM测定V-120·28和V5A5-120·29凝聚体的荧光寿命分别为3.84 ns和3.28 ns。接下来，我们利用共聚焦和FLIM在561 nm激发下对V-120·28/V5A5- 120·29凝聚体进行成像，显示出两层不混相结构。FLIM图像通过其不同的寿命明确区分了单个凝析油中的两种elp。我们测试了对感兴趣蛋白(POI)的活细胞成像。以HaloTag和SNAP-tag为代表的自标记蛋白标签已被广泛用作生命科学的有力工具，特别是用于活细胞中特定POI的双正交标记。接下来，我们将HaloTag或SNAP-tag的反应弹头安装在两个绿色发射的BODIPY衍生物30和31上。表达HaloTag融合H2B蛋白(定位于核质)和snaptag融合NPM1蛋白(定位于核仁)的U-2 OS细胞用探针30和31孵育，进行共价标记，然后在488 nm激发下进行共聚焦和FLIM成像。虽然30和31的生存期在融合蛋白中略有改变，Halo-H2B*30为6.62 ns, SNAP-NPM1·31为5.40 ns，但寿命差异仍然足以在活细胞中分离这两种蛋白。
活细胞亚细胞寿命成像
我们测试了基于BODIPY的探针是否可以用于生成细胞器靶向探针，并实现对同一细胞中多个细胞器分离的光谱-时间成像。为此，我们选择研究溶酶体和内质网(ER)，将它们已建立的细胞器靶向部分安装到基于BODIPY的探针上。在红色通道中，我们合成了溶酶体靶向探针和er靶向探针，它们的寿命不同，分别为3.60 ns和4.67 ns。U-2 OS细胞用溶酶体靶向(32)和er靶向(33)探针孵育，在561 nm激发下用共聚焦和FLIM成像。32和33的靶向特异性通过市售的细胞器标记染料共定位得到证实。FLIM显示染料标记溶酶体和内质网根据其寿命明显分离，相量分析证实了两种分布狭窄的细胞器的不同寿命。对绿色发光的BODIPY探针进行了类似的实验，合成了溶酶体靶向探针(34)和er靶向探针(35)，它们的寿命不同，33的寿命为4.86 ns, 34的寿命为6.59 ns。通过FLIM成功分离ER和溶酶体这些结果表明这些合理设计的探针在活细胞荧光寿命复用成像中的潜在应用。
总结
综上所述，我们提供了化学策略来调节具有不同光谱特征的BODIPY支架的荧光寿命。基于这些原理，我们生成了一系列包含不同光谱特征和激发态寿命值的BODIPY衍生物。这些合成探针应用于FLIM实验，利用荧光寿命作为信号来区分体外样品或活细胞中的靶标。有趣的是，我们发现结构取代基的电负性对荧光寿命有深远的影响。对于典型的绿色BODIPY衍生物，8位取代基的电负性和空间位阻都影响荧光寿命。特别是，强给电子和吸电子取代基导致显著的PET和寿命缩短。对于发红光的BODIPY衍生物，荧光寿命受影响ICT过程的5位取代基的电负性调节。具体来说，富电子芳基增强了ICT过程，导致寿命短。因此，化学取代基的电负性可以通过不同的机制来调节具有不同光谱特征的BODIPY衍生物的荧光寿命。
参考文献
Chemical Control of Fluorescence Lifetime towards Multiplexing Imaging Junbao Ma+ , Feng Luo+ , Chia-Heng Hsiung, Jianan Dai, Zizhu Tan, Songtao Ye, Lina Ding,* Baoxing Shen,* and Xin Zhang*,Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202403029，https//doi.org/10.1002/anie.202403029
