内容提要
单分子定位显微镜(SMLM)通过超越衍射极限和揭示以前无法实现的细胞结构和分子动力学的纳米级细节，彻底改变了光学显微镜。这种超分辨率成像能力依赖于荧光团的光电开关，这对于优化成像条件和准确确定荧光团的位置至关重要。为了了解单个染料分子的一般开关机制，对各种开关试剂进行了评价。系统测量了各种光开关试剂存在下的单分子水平荧光的开关率(kon和koff)，并对光开关试剂-荧光团对的结构进行了理论计算，结果表明，开关机制主要由光开关试剂的亲核性决定，开关机制是双光子诱导的解离过程。这与照明激光的功率和这对电子的键解离能有关。该研究有助于更广泛地了解SMLM成像中的分子光开关机制，并为设计改进的光开关试剂提供了基础，具有扩展到材料科学和化学的潜在应用前景。
结果与讨论
双光子诱导光开关试剂与染料分子解离使染料恢复荧光状态的机理
我们首先使用紫外/可见吸收光谱和质谱法研究了染料光电开关试剂加合物的形成。在模拟和实验紫外/可见吸收光谱中，我们观察到Alexa Fluor 647 (AF647)的吸收峰强度(647 nm)降低，并且在加入了开关试剂后，新形成了一个蓝移峰强度(200-400 nm)，这意味着AF647-开关试剂加合物形成了暗态。我们还可以从质谱中观察到af647 -光电开关试剂加合物在高pH下加速加成的形成。基于这一证据，我们下一步研究了关闭到打开恢复步骤的机制。我们最初用激发激光功率(0.15-1.7 kW/cm2)的变化来测量kon。在以前的研究中，恢复开关过程的速率被认为是一阶的。随着激发激光功率的增加，恢复速率(kon)也随之增加。值得注意的是，在非常低的激光功率(0.15 kW/cm2)下，染料(可能是染料-硫醇加合物)的暗态倾向于持续更长时间，导致回收率非常慢(kon)。相比之下，在高激光功率(>0.85 kW/cm2)下，染料的暗态可以快速转换为荧光态，从而实现超分辨率成像所需的快速光开关。这不仅解释了为什么SMLM成像需要高激光功率，而且还表明硫醇与染料硫醇加合物解离的概率与光子能量有关。kon与激光功率的对数尺度图的斜率约为2，表明关闭到打开的恢复过程是双光子过程。这种双光子染料荧光恢复过程与从暗态激活染料所需的高激光功率是一致的。采用功率为17-51 W/cm2的405 nm激光器与低功率(0.15-0.2 kW/cm2)激光器(647 nm)联合激发，评价了紫外加性光照对该工艺的影响。即使是低激光功率(0.15-0.2 kW/cm2)的紫外线照射也可以通过增加kon来加速这一过程。因此，利用低激光功率(~0.2 kW/cm2)的紫外照射结合低功率(0.15-0.2 kW/cm2)激光器(647 nm)的激发，实现了染料的加速光开关。通过紫外线照射将染料恢复到荧光状态也与先前观察到的紫外线对还原染料的光活化一致。因此，即使在低功率激光或红色激光的两个光子激发下，蓝色光子(在紫外范围内)也可以诱导染料从暗态解离到荧光态，这可以解释为什么需要高激光功率激发或紫外线激活来激活染料的开关现象。
为了进一步研究激光照射诱导染料分子与硫醇之间键解离的机理，通过理论计算确定了染料-硫醇加合物的基态和第一激发态。有趣的是，我们构建了第一激发态的解离能曲线。因此，模拟势能图表明，一旦染料硫醇加合物被激发到第一激发态，它就会迅速遵循解离曲线，导致染料和硫醇分子解离。从基态(S0)激发到第一激发态(S1)所需的能量为~345 nm，高于红光的能量(647 nm)和647 nm光的约双光子能量。随着染料分子与硫醇之间的键(cs键)长度的增加，激发能降低。因此，405 nm光子也有望将染料硫醇分子激发到解离激发态。当硫醇以中性形式(R SH)与去质子化形式(R S)结合在染料分子上时，计算得到的激发能更低(~560 nm)。在这种情况下，一个蓝色光子(405 nm)，即使在低功率下，也可以诱导染料-硫醇对的解离。
为了证实所提出的染料-光开关试剂中键解离导致染料恢复到荧光状态的双光子机制，我们评估了与具有不同结合能的染料分子相互作用的各种候选光开关试剂。如前文所述，以往关于光开关机理的研究仅将硫醇作为光开关剂，限制了新型光开关试剂的进一步开发。为了概括光开关机理，我们选择了各种能与染料分子以不同结合能相互作用的分子作为光开关试剂，包括硫醇(MEA、DTT)、胺(丙氨酸、甘氨酸)、羟基(乙醇、过氧化氢)、卤化苯(氯苯、碘苯)和氢化物(氢化钠)基团。为了评估光导试剂和染料分子之间的键能对染料恢复到荧光状态的影响，在单分子水平上测量了暗态(即染料-光导试剂加合物)的寿命τoff。测量得到的τoff作为计算得到的试剂和染料分子之间的键能的函数。有趣的是，具有强键能的光开关试剂，如BH4，具有较长的暗态寿命，而具有弱键能的光开关试剂，如硫醇(MEA, DTT)，具有较短的暗态寿命。因此，与具有高结合能的染料分子相互作用的候选光开关试剂往往停留在关闭状态更长时间，使恢复到荧光状态变得困难。
这表明染料与光导试剂分子之间键的解离能量决定了染料回收过程中暗态的寿命，这与所提出的机理一致。假设染料回收的活化能近似等于染料与光开关试剂之间键的解离能，则键解离与ln(τoff)之间的线性关系可以预期。我们观察到ln(τoff)与键解离能呈线性关系，再次证实键解离过程是影响荧光恢复的主要因素。鉴于染料与光导试剂分子之间的结合能在荧光恢复过程(即开关过程)中的重要作用，我们提出结合能会影响光导循环的次数。为了研究这种影响，测量了与不同能量的染料分子结合的各种光开关候选试剂的开关循环次数。随着染料和光开关试剂之间结合能的增加，通过激光照射诱导从暗态到荧光态的反转变得更加困难，从而减少了光开关周期的次数。例如，在BH4的存在下，染料经历了几个光开关周期(平均为~2.5)，这似乎是由于H和染料分子之间的强键合。即使氢化物离子被添加到吲哚胺碳上，而不是先前的研究中观察到的聚甲基桥上，H和染料分子之间的这种强键也可以观察到。虽然已知聚甲基桥上的第二个碳是最可能加入还原分子的位置，但由于它们的小尺寸，预计氢化物离子将被添加到空间受阻的吲哚胺碳上。在模拟和实验紫外/可见吸收光谱中，与其他染料光电开关试剂加合物相比，基于其相对红移的吸收峰，我们还观察到在吲哚胺碳上加氢离子而不是在聚甲基桥上的第二个碳上加氢离子而形成氢菁。由氢化物离子在吲哚碳上加成的氢菁的键解离能为425 kJ/mol，是所有测试的光开关试剂中键解离能最强的，仍然解释了我们观察到的最长τoff和最少的光开关循环数。有趣的是，这种少量的光开关周期可以通过紫外光(405 nm)的额外激活来增加，这意味着在高能激光照射下增强了可逆性。综上所述，荧光脱色过程和光开关的可逆性主要由染料与光开关试剂分子之间的键能决定。
由光开关试剂的亲核性决定的开关机制
在染料的开关动力学的变化系统地研究了各种光导试剂，以前没有评估。基于先前提出的硫醇加入染料分子的机制，我们提出了光电开关试剂的位阻可以影响开关过程，因为它是决定亲核性的主要因素。因此，我们评估了(在染料-试剂加合物中)光电开关试剂的位阻对荧光导通态寿命(τon)的影响。
正如预期的那样，当具有高锥角的光导试剂存在时，染料倾向于保持更长时间的荧光状态，从而导致更长的τon，因为体积庞大的光导试剂可能无法有效地附着在染料分子中的共轭键上。例如，具有大量官能团的光电开关试剂，如氯苯、4-苯基吡啶n -氧化物和碘苯，由于与染料分子相互作用差，往往保持在荧光状态更长时间。相比之下，具有低锥角的光开关试剂，如BH4，表现出更短的τon，因为这种光开关试剂很容易添加到染料分子中。因此，通过控制染料分子的接近性，光开关试剂的体积是决定开关机制的主要因素之一。
除位阻效应外，取代基对亲核试剂的亲核性也有影响。例如，含苯基团的分子，如4-苯基吡啶氧化物、氯苯和碘苯，由于共振使亲核孤对离域，亲核性较差。亲核性对染料的影响可以在这些苯分子的存在下观察到，其中荧光态的寿命(τon)较长，表明亲核性较低。由于较长的荧光开启寿命可能导致点扩散函数(PSF)与较长的寿命重叠的高概率，因此在共振基团中具有亲核孤对电子的光开关试剂不适合用于单分子成像。此外，已知胺基的亲核性在吸电子基团(如羧基)的存在下会降低。这种效应也被观察到从测量荧光寿命(τon)的光开关试剂与胺基团。在具有羧基的光开关试剂(如丙氨酸和甘氨酸)存在下，与具有相似锥角的其他光开关试剂存在下的寿命相比，染料的荧光寿命(τon)增加。为了证实这一点，还测量了染料在甲胺或二甲胺存在下，具有一个或两个给电子甲基的荧光寿命(τon)。在这些试剂的存在下，荧光开启状态的寿命(τon)较短，表明这些试剂与具有吸电子基团的胺分子(如甘氨酸和丙氨酸)相比具有高亲核性。这表明，光开关试剂的亲核性在决定荧光开关过程中起着重要作用。同时，pKa和τon之间没有明显的关系，这表明光开关试剂的碱度并不直接影响荧光寿命。。总的来说，这些数据表明，在光开关过程中，决定荧光寿命(τon)的主要因素是光开关试剂的亲核性，而不是碱度。
生物样品的STORM图像质量与光开关剂类型的关系
我们在系统量化各种光开关剂的光开关过程的基础上，研究了生物样品的STORM图像质量。根据与染料分子的结合能和亲核性，将所测光开关试剂大致分为四类:(1)结合能较弱、亲核性较好的光开关试剂(即MEA和DTT)。(2型)具有中间结合能和亲核性差的光开关试剂(即甘氨酸和丙氨酸)。(3)具有强结合能和亲核性的光开关试剂(即BH4)。(4)化学能强、亲核性差的光开关试剂(即氯苯和碘苯)。表S1总结了各类光开关试剂的光开关性能，便于对各种光开关试剂进行比较。考虑到每种类型的光开关试剂的测量光开关速率、光子数和定位精度，预计类型1将在AF647染料中诱导最佳的光开关性能，而类型4将表现出最差的光开关性能。为了评估STORM图像质量，我们对af647标记的微管在每种类型的光开关剂存在下进行了STORM成像，并从STORM图像中测量了微管细丝的宽度和一维定位密度)。正如预期的那样，1型光开关试剂具有弱的结合能和良好的亲核性，通过显示窄宽度和高定位密度的微管的空心结构，产生了最好的STORM图像质量。中空和狭窄微管细丝的高分辨率STORM图像是由快速光电开关过程(高kon和koff)产生的，这与单分子测量结果一致。此外，当使用1型光电开关试剂时，高开关周期数所产生的高定位密度有助于STORM图像的高分辨率，这与之前描述的单分子测量结果一致。当使用具有中等结合能和亲核性差的2型光开关试剂时，这种空心微管细丝的观察受到影响。
由于染料在2型试剂存在下的开、关光过程都比在1型试剂存在下的开、关光过程要慢，所以用2型光开关剂拍摄的STORM图像中微管的定位密度比用1型试剂获得的图像要低。2型试剂在STORM成像中经常显示重叠的psf，可能是由于kon和koff较慢，导致厚微管细丝。在3型试剂存在时很少观察到这种重叠的psf，因为3型试剂具有很强的结合能和良好的亲核性，这是由于荧光态(τon)的寿命短。然而，由于与染料的强结合能导致的低光电开关周期导致微管细丝的低定位密度，这限制了STORM图像的质量。最后，化学能强、亲核性差的4型光电开关试剂，在不同类型的试剂中，kon和koff反应最慢，因此产生的STORM图像质量最差。
由于荧光状态持续时间长，许多psf重叠，导致微管灯丝中的点定位错误。此外，在4型试剂的存在下，染料的荧光关闭状态的长寿命有助于减少光开关周期的次数，使STORM图像质量恶化。通过傅里叶环相关(FRC)和去相关分析也证实了STORM图像中观察到的分辨率变化取决于光开关试剂的类型，这两种方法都是测量超分辨率图像分辨率的成熟方法。我们分别从FRC和去相关分析中获得了21和25(类型1)，25和32(类型2)，23和28(类型3)以及65和80 nm(类型4)作为分辨率。这些结果表明，与类型4相比，类型1表现出最好的STORM图像质量。我们还使用不同类型的光开关试剂对各种生物结构(包括线粒体和ccp)进行了STORM成像。如图3f和S5所示，1型试剂由于其更快的光导率和较短的τon和τoff，显示出线粒体和ccp的明显中空结构，而这种中空结构不明显，特别是当使用4型试剂时，由于其在试剂类型中τon和τoff最长。这意味着在一般超分辨率成像中，类型1具有良好的光电开关特性，而类型4具有最差的光电开关特性。因此，我们以与我们的单分子测量一致的方式观察了光开关试剂对生物样品的STORM图像质量的影响。
在系统研究了对STORM成像质量影响的基础上，确定了最佳的光开关试剂。虽然硫醇已被广泛用作光开关试剂，但在需要硫醇替代品的情况下，寻找其他合适的光开关试剂是很重要的。因此，我们试图在系统研究各种光开关试剂的基础上，确定另一种光开关试剂。与染料分子结合能弱且亲核性好的光开关试剂可以诱导染料快速光开关，从而获得高分辨率的STORM图像。在这方面，由于叠氮离子(N3)具有良好的亲核性，并且与染料分子的结合较弱(191 kJ/mol)，因此有望成为一种良好的光开关试剂。通过改变成像缓冲条件，包括pH和浓度，优化了染料在NaN3存在下的光开关，以获得染料分子的快速kon和koff。如图3g所示，用NaN3成像的每个微管细丝分辨率都很好，显示出狭窄的宽度和空心结构。NaN3良好的超分辨率成像能力也被成功证明用于线粒体和ccp的STORM成像。与2-4型相比，使用NaN3获得的STORM图像显示线粒体和CCPs明显空化，这表明NaN3可以广泛应用于生物靶点。我们还对微管、线粒体和ccp的STORM图像进行了FRC和去相关分析。如图3h所示，使用NaN3获得的STORM图像的分辨率与使用Type 1获得的分辨率相当，这表明NaN3是一种高效的光开关试剂。因此，我们可以证实NaN3作为一种类似于硫醇的良好的光开关试剂具有超分辨率成像能力。因此，目前对光开关机制的研究为寻找合适的替代硫醇的光开关试剂提供了指导。
总结
在本研究中，研究了不同的光开关试剂存在下荧光团的光开关动力学。通过对AF647在各种光开关试剂的辅助下的通-关和关-通过程的速率进行量化，研究了决定各速率的主要因素。例如，主要由位阻和取代基决定的光开关试剂的亲核性在决定荧光的开-关速率中起着重要作用，因为这一过程是通过在染料分子中的共轭键上加入光开关试剂的亲核性而发生的。关闭率对激光功率的依赖表明，荧光团-光开关试剂对存在双光子诱导解离，这表明该对的键解离能是决定荧光恢复率和开关周期数的主要因素。理论计算表明，激发态能级呈现解离曲线，这是以前没有报道过的。因此，一旦被两个红色光子或一个蓝色光子激发到这个解离能级，染料-光电开关试剂对就很容易解离。综上所述，这些结果表明，使用亲核性好、与染料分子结合能弱的光电开关试剂，可以实现高质量STORM图像所需的快速开关现象。然而，需要注意的是，我们的这种光开关机制是建立在将光开关试剂添加到聚甲基桥的共轭键上，形成非发射光产物的假设之上的。因此，我们的主张可能不适用于不能形成光开关试剂加合物的染料分子，如先前报道的具有较短聚甲基桥的Cy3和具有刚性结构的Cy3B，需要使用不同方法对不同类型的染料进行进一步研究。
在对各种光开关试剂进行系统研究的基础上，由于叠氮化物离子(N3)具有良好的亲核性和对染料分子的弱结合能，我们测试了NaN3作为一种新的光开关试剂。正如预期的那样，当使用NaN3作为光开关试剂时，观察到快速的光开关打开和关闭动力学，导致单分子的psf分辨率高，没有重叠，并产生高质量的STORM图像。我们期望通过优化成像缓冲液的组成，如pH和浓度，以及照明条件，如激光功率和波长，可以进一步提高光电开关性能。以往的SMLM研究只考虑了硫醇作为光开关剂，而本研究不仅可以扩展到更多种类的光开关剂，而且通过为新型光开关剂和成像条件的优化设计提供指导，提高了SMLM图像质量。
参考文献
Photoswitching Reagent for Super-Resolution Fluorescence Microscopy ，Ga-eun Go, Uidon Jeong, Hyunbum Park, Seokran Go, and Doory Kim*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202405246，http// doi.org/10.1002/anie.202405246
