内容提要
本研究使用共轭聚合物聚[2-甲氧基-5-(2'-乙基己氧基)-1,4-苯乙炔]（MEH-PPV）合成了一个亲脂性的荧光Pdots（Bare-Pdots）来系统性评估其在干细胞、斑马鱼胚胎及小鼠体内的生物分布和生物毒性。研究结果显示Bare-Pdots更容易被细胞内化或吸附在胚胎绒毛膜上。此外，Bare-Pdots会在高能量需求的组织如棕色脂肪和心脏存在特异性分布。这种特异性分布与组织内参与脂质代谢的毛细血管内皮细胞的吞噬相关。其中，以5 mg kg-1的高剂量注射九十天后会导致棕色脂肪形态功能的障碍，并且存在导致肥胖的风险。另外，我们使用两亲性配体修饰MEH-PPV合成了亲水性COOH-Pdots和较低亲脂性的NH2-Pdots。结果显示NH2-Pdots与Bare-Pdots呈现相似的分布特性，但体现出更低的生物毒性。然而，以5 mg kg-1剂量注射的COOH-Pdots导致小鼠白细胞数目降低和肾小管损伤。
结果和讨论
Pdots的合成和性能表征
作为聚对亚苯基亚乙烯基衍生物，具有不对称烷氧基侧链的MEH-PPV凭借在有机溶剂的高溶解度和优异的发光特性被广泛的应用于聚合物纳米颗粒的设计。因此，我们使用MEH-PPV(average Mn: 40 000−70 000 Da)通过共沉淀的方式合成Bare-Pdots。Bare-Pdots的外部除了MEH-PPV在形成纳米颗粒时形成的化学缺陷无额外的亲水性基团修饰而拥有最高的亲脂性。此外，为了进一步比较不同亲脂性的Pdots的生物分布和生物毒性，我们利用两亲性聚合物PS-PEG-COOH和PMMA-NH2作为外部配体分别合成了COOH-Pdots和NH2-Pdots。其中PMMA-NH2中甲基丙烯酸甲酯长链相对于亲水性PEG接枝的聚苯乙烯长链有更高的亲脂性。首先我们使用红外光谱确定两种配体在外部的修饰。相对于Bare-Pdots，COOH-Pdots由于COOH基团的引入使得在1730 cm-1左右出现一个羰基（C=O）吸收峰，同时增加的重复CH2单元使得2850 cm-1和2920 cm-1处的吸收增强。而NH2-Pdots则由于酯键和酰胺键的存在使得在1730 cm-1处C=O的伸缩增强，出现一个很强的吸收峰。此外，尽管与两亲聚合物的整体结构相比，亲水官能团的含量相对较低，但NH2-Pdots中N-H和COOH-Pdots中O-H的伸缩振动导致两种Pdots在3394 cm-1处出现吸收峰。然后，我们选择正辛醇-水体系测定的油水分配系数（logP）来确定不同配体修饰后Pdots的亲脂性变化。Bare-Pdots的logP最大为2.84，其次是NH2-Pdots（2.29），而COOH-Pdots的logP为-1.27。根据Lipinski五法则，logP为0-3的化合物具有中等亲脂性，logP越高亲脂性越高，而logP < 0则为亲水性。根据这个规则，Bare-Pdots和NH2-Pdots具有中等亲脂性，而COOH-Pdots则是亲水性。此外，Bare-Pdots和COOH-Pdots水动力尺寸在70nm左右，NH2-Pdots的粒径约为110nm。三种Pdot的PDI都小于0.2。此外，三种Pdots的电势都小于-26mV，在含10%FBS的培养基和HEPEs缓冲液中具有较好的稳定性。本研究还对三种Pdots在小鼠体内循环时间进行检测。结果表明Bare-Pdots的循环时间为0.45h，COOH-Pdots由于外部PEG的修饰使得在体内的循环时间最长为1.84h。NH2-Pdots的时间最短为0.19h，这可能归究于较大的粒径更容易被肝脏巨噬细胞捕获。
细胞摄取和细胞毒性评估
在体外的细胞实验中，我们借助荧光成像研究各组Pdots以5mg和50mg剂量在骨髓间充质干细胞（BMSCs）内的定位。即使在5mg的低剂量下，Bare-Pdots在细胞核周围有大量分布，且这种分布随着浓度的增加而增加。在50mg的高剂量下，NH2-Pdots会在细胞核周围有较强的荧光分布，COOH-Pdots则依旧没有被摄取。纳米颗粒的理化性质是影响细胞内化的关键因素。具体来说，纳米颗粒的大小、形状、电荷和疏水性都会影响它们与细胞的相互作用。三种类型的Pdots，尤其是Bare-Pdots和COOH-Pdots，表现出相似的大小、形状和电势，但它们在亲脂性和亲水性方面存在显著差异。与亲水性Pdots相比，亲脂性Pdots由于疏水效应更容易被吸附和聚集在细胞膜上，从而提高了细胞内化的可能性。考虑到Pdots在体内暴露时对组织驻留干细胞的可能影响，本研究选择了3种组织干细胞（棕色脂肪干细胞、白色脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞）和人真皮成纤维细胞（HDFs）进行细胞毒性试验。在共孵育24h后，即使在Pdots浓度达到100 μg mL-1，细胞的存活率仍在90%以上，这显示三种Pdots都具有较好的细胞相容性。值得注意的是，亲脂性Pdots在细胞核周围的大量分布，虽然在短期内无明显毒性，但可能会影响细胞的生长发育。
Pdots对斑马鱼胚胎发育的影响
一些研究表明Pdots能够穿过胚胎屏障，进入羊水，从而使得早期胚胎有可能暴露于含Pdots的环境中。因此，评估Pdots在胚胎上的生物相容性是十分有必要的。斑马鱼是一种广泛用于探索人类疾病、发育和生理学的动物模型。由于其胚胎具有光学透明度和低实验成本，因此本文章选用斑马鱼胚胎来检测Pdots是否会对胚胎发育生长的过程产生影响。为了探究三种Pdots对胚胎是否产生剂量依赖的生物效应，我们将12hpf的斑马鱼胚胎分别与不同浓度的Pdots共培养24h后，在24hpf，48hpf，72hpf和108hpf的时间点进行明场和荧光成像。从24hpf的成像图可以看出，相对于COOH-Pdots，两种亲脂性的Bare-Pdots和NH2-Pdots在胚胎外部有大量吸附。结合共聚焦单层荧光成像图,可以进一步确定三种Pdots主要积聚在胚胎绒毛膜外部，并未进入到胚胎内部。这种对胚胎绒毛膜的吸附会随着Pdots浓度增加而增加。从24hpf到72hpf，斑马鱼幼虫逐渐从绒毛膜中孵化出来，九个实验组中的胚胎孵化率和对照组几乎没有差异性，并且在108hpf也未观察到斑马鱼幼虫出现躯干畸形或心包水肿等表型异常。这些都说明Pdots拥有良好的生物相容性，并未对斑马鱼胚胎发育生长造成影响。通过在72hpf收集的绒毛膜和斑马鱼幼虫的荧光成像可以说明吸附在绒毛膜外部的Pdots没有进入到幼虫内部，主要是吸附在胚胎膜上，并随着幼虫的孵化而脱落，这可能是由于绒毛膜的高度屏障作用以及绒毛膜上蛋白等结构对Pdots的紧密吸附。此外，具有亲脂性Pdots对胚胎膜的稳定吸附也使得其有可能成为膜标记染料用来检测胚胎存活及发育情况。
生物分布分析
我们监测了静脉注射Pdots 90天的雄性小鼠。三种Pdots的注射剂量分别为1.25或5 mg kg-1，分别命名为COOH-low，COOH-high，NH2-low，NH2-high，Bare-low和Bare-high。考虑到三种Pdots的血液半衰期都不超过2h，因此在注射第三天时三种Pdots已经在全身血液循环并形成特定组织分布。各实验组在注射3天后都在肝和脾都有较高的荧光分布，同时也在不同组织有特定的累积特性。Bare-Pdots的荧光则主要集中在iBAT，Bare-low和Bare-high的荧光强度分别是同剂量组肝脏的0.9倍和0.7倍。此外，Bare-Pdots在心脏、iWAT和肌肉的分布也明显高于对照组，这是由于这些高能量需求的组织内毛细血管内皮细胞(CECs)的特异性摄取所致。当亲脂性的Pdots被尾静脉注射后，其会与在血液循环的TRLs结合。然后，与CECs上表达的糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白结合蛋白1（GPIHBP1）连接的脂肪蛋白酶会将负载Pdots的TRLs脂解，使其体积变小从而达到非吞噬细胞颗粒内吞作用的尺寸上限。随即，这些TRLs的残余颗粒经CECs上CD36介导的内吞作用进入到细胞内部。这种CECs主要存在于特异性摄取外来脂质的iBAT、心脏和骨骼肌组织，参与机体的脂质代谢。亲脂性的NH2-Pdots和Bare-Pdots在组织中有相似的分布。亲水COOH-Pdots组小鼠在iBAT和心脏中荧光较低，而在睾丸和肾脏中荧光较强，这可能是由于其较长的血液循环时间进而更容易被实质器官所捕获。六个实验组在脑组织的分布和对照组没有差异性，这说明Pdots并未通过血脑屏障进入到脑部组织。在注射14天时，各组Pdots相对于注射后第3天的荧光强度降低。Bare-Pdots的清除相对较慢，在iBAT和心脏的荧光强度下降不超过30%。NH2-Pdots和COOH-Pdots在肝脏、脾脏和心脏中的清除率更快。在注射90天后，各个实验组尤其高剂量组的Pdots的荧光轻度大大降低。然而与对照组相比，各实验组内组织间Pdots的积累仍存在差异。值得注意的是，随着时间的积累，COOH-Pdots在淋巴结中的荧光逐渐增加。虽然相对较低，但这种积累可能会影响身体的免疫反应。
为了进一步探索三种Pdots在组织内部的分布特性，我们将注射14天后离体组织切片染色。Bare-Pdots在心脏组织中呈条纹状分布，集中在细胞核周围，其荧光强度远高于其他两组。Bare-Pdots和NH2-Pdots在iBAT中均呈密集的点状分布。此外，为了确认亲脂性Pdots在心脏和iBAT中的特异性分布是否与毛细血管内皮细胞的吞噬作用有关，我们对冷冻切片进行了CD31的免疫染色。切片中Pdots的荧光信号几乎与CD31的荧光信号完全重叠。COOH-Pdots主要是在睾丸间质和附睾间质停留，并未进入到生精小管或附睾管中。其他组织切片的荧光强度也与IVIS定量结果保持一致。
生物毒性评估
基于Pdots的分布特征，我们从体重、体征、病理和血液学的角度对小鼠的急性毒性进行了综合评估。首先，我们监测了所有组小鼠的体重。结果显示，与对照组相比，Bare-high组的体重增加。同时，我们发现注射90天后Bare-high组iBAT的病理切片出现增大的脂滴，显示多房棕色脂肪细胞向单房白色脂肪样细胞转变，出现“棕色脂肪白化”现象。iBAT负责适应性产热，响应外部温度或能量刺激，以维持体内的代谢平衡。相对于单房大脂滴，棕色脂肪内小而多房型脂滴与脂肪分解酶接触面积更大，从而有效促进脂肪分解产生供线粒体β氧化和产热的脂肪酸，并且有利于加快脂肪酸运输到脂滴相邻的线粒体过程。因此，棕色脂肪脂滴的从多房小脂滴变成单房大脂滴可能反映了棕色脂肪细胞功能的转变，从产热为主转变为以储存能量为主，这种转变可能导致肥胖的风险增加。Bare-Pdots由于不含有天然可降解基团，因此在被iBAT中毛细血管内皮细胞摄取后并不会被介导进入到周边脂肪组织。作为一个高度血管化的组织，棕色脂肪的毛细血管不仅为棕色脂肪的氧化产热提供足够的氧气，同时也通过多种分子机制维持脂肪细胞稳态和调解脂肪细胞的重塑。有研究提出肥胖中毛细血管的稀疏和缺氧通过导致线粒体功能障碍和损失使得棕色脂肪白化。我们在iBAT的CD31的免疫荧光染色中发现相对于Control组，Bare-high中血管密度也明显下降。综上所述，我们推测亲脂性Pdots在棕色脂肪CECs长时间大量积累有可能对其产生毒害，从而使得棕色脂肪组织内毛细血管密度下降，这导致棕色脂肪白化。然而，棕色脂肪与白色脂肪相互之间的转变及其对机体代谢的影响都受复杂的分子机制调控，因此Bare-Pdots对棕色脂肪的影响还有待进一步的研究探索。
在血液学诊断方面，我们在注射后第3、14和90天测量了各种血细胞参数，包括白细胞（WBC、LBM、MON和GRA）、红细胞（RBC、HGB和RDW）和血小板（PDW）。亲脂性Bare-Pdots和NH2-Pdots的血常规指标均未超过正常范围。然而，COOH-high组小鼠在注射第90天后的白细胞数目显著降低。白细胞反映了身体的免疫状态。鉴于前面提到的COOH-Pdots在淋巴结中的积累，我们推断随着时间的推移，高剂量注射COOH-Pdots会对机体免疫系统产生不良影响。由于MEH-PPV不含天然可降解基团，Pdots很难被机体所代谢。大多数Pdots主要通过肝胆途径排出体外，而极少量的小Pdots（小于6 nm）可通过肾-尿途径排出。因此，我们通过检测小鼠血清的化指标，进一步评估了肝脏（ALT和AST）和肾脏（BUN和CREA）毒性。各实验组肝肾功能生化指标均在正常范围内，说明即使在COOH-high组小鼠存在肾小管变性的情况下也并未出现严重的肝、肾损伤。
结论
我们使用干细胞、斑马鱼胚胎和小鼠三种模型，系统地评估了具有不同亲脂性的Pdots的生物分布和生物毒性。与亲水性COOH-Pdots相比，亲脂性Bare-Pdots和NH2-Pdots更容易被细胞吞噬并吸附在斑马鱼胚胎膜上。此外，三种Pdots对细胞和斑马鱼胚胎都具有良好的生物相容性，即使在MEH-PPV浓度高达100 μg mL−1的情况下，也没有产生明显的毒性。此外，体内实验结果表明，亲脂性Bare-Pdots在iBAT和心脏等具有高能量需求的组织中具有特异性的累积。亲脂性NH2-Pdots的分布与Bare-Pdots的分布相似。亲水的COOH-Pdots由于其血液循环时间较长，更容易被睾丸和淋巴结等实质器官所捕获。通过病理分析和血液学诊断，我们发现高剂量注射（5 mg kg−1）Bare-Pdots组的小鼠在注射后90天出现棕色脂肪形态及功能障碍和体重增加。而COOH-high组小鼠的白细胞数目减少，这说明其可能对身体的免疫系统产生了影响。此外，低剂量（1.25 mg kg−1）注射三种Pdots均没有引起明显的组织毒性。这些结果将为荧光聚合物纳米探针在临床医学前的特异性递送设计和使用剂量制定提供生物安全信息。
参考文献
Biodistribution and Biotoxicity Assessment of Fluorescent Conjugated Polymer Dots, Panting Ren; Jingru Li; Liqin Xiong*, Adv. Healthcare Mater. 2024, 2401737. https://doi.org/10.1002/adhm.202401737.
