内容提要
本研究我们设计了一系列极性响应的、长寿命的荧光探针，能够靶向细胞膜。这些 探针将吖啶酮和喹吖啶酮(QA)作为核心荧光团， 胆固醇(亲脂锚)或磺酸(亲水基团)作为膜靶向部分。这些基于吖啶酮/喹吖啶酮的探针具有热激活延迟荧光 (TADF)，可以利用其分子内电荷转移(ICT)特性和极性敏感的三重态动力学来提供寿命偏移，提供了对微环境变化的高灵敏度。长探针寿命使后期、时间门控检测能够抑制短寿命的细胞自身荧光和检测器背景，从而增加寿命对比度并稳定配合。
结果与讨论
探针的合成和光物理性质研究
吖啶酮的苯环 2 位进行甲氧基化，对喹吖啶酮的 N 端进行功能化修饰，引入胆固醇或含磺酸基的长烷基链。探针在不同溶剂（如 DMSO、THF、THF-H₂O 混合体系）中的紫外-可见吸收光谱，确定吸收峰位置（如 CQSC10 在 DMSO 中吸收峰为 491 nm 与 525 nm）。荧光发射光谱，分析发射峰位置（如 CQSC10 在 DMSO 中发射峰为 538 nm 与 577 nm）及溶剂极性对光谱的影响（如 THF-H₂O 体系中，水含量增加导致吸收与发射峰红移）。探针在不同溶剂及细胞中的荧光寿命，结果显示 CMFL-QASAG 系列寿命达 18 ns 左右，溶剂中寿命偏移（Δτ）为 5-23 ns，细胞膜中为 16-20 ns，远超传统探针；CMFL-Chol 在 THF 中寿命为 16.4 ns，CMFL-SAG 在 DMSO 中寿命为 11.5 ns。测定探针量子产率，CMFL-QASAG 系列在 DMSO 中量子产率约 90%，CQSC10 在水溶液中达 50%，CMFL-Chol 在 THF 中量子产率为 93.07%，CMFL-SAG 在 DMSO 中为 62.30%，表明喹吖啶酮类探针光致发光效率更高。在 THF-H₂O 混合体系中（水含量 0%-90%），通过荧光寿命变化分析探针极性响应：水含量 0%-8% 时，CQSC10 呈现双指数衰减（短寿命 <10 ns、长寿命 10-20 ns），且长寿命占比随极性升高增加；水含量> 8% 时，转为单指数长寿命衰减，证明探针寿命与溶剂极性呈良好线性关系，且 pH、粘度对寿命影响极小，确认极性为调控探针寿命的核心因素。从多维度系统表征基于喹吖啶酮的长寿命探针性能：光物理参数表显示，CMFL-QASAG 系列（C6、C8、C10）具有超长荧光寿命（约 18 ns）、高量子产率（>90%）及显著的摩尔消光系数，远超传统探针；三维荧光光谱直观呈现探针的双发射峰特征及随溶剂极性的红移现象；荧光衰减动力学曲线揭示了探针在不同水含量体系中从聚集体（双寿命）到单体（单寿命）的解离过程；进一步证明其荧光寿命与溶剂介电常数、水含量呈良好线性关系，可作为极性 “传感器” 定量反映微环境极性；光学照片则直观展现了探针在可见光和紫外光下的优异发光性能。这些结果共同表明，该系列探针凭借超长寿命、高极性敏感性和良好光学稳定性，能够有效规避细胞自发荧光干扰，为细胞膜异质性的精准成像与微环境定量分析提供了可靠工具。
探针在细胞膜极性动态监测与功能微域成像研究
采用 CCK-8 法，对 U87MG 细胞（胶质瘤细胞）分别加入 0-50 μM 的 CMFL-QASAG 探针，培养 24 h 后测定 450 nm 处吸光度，计算细胞存活率。结果显示各浓度下细胞存活率无显著下降，证明探针具有良好生物相容性，可用于活细胞成像。通过激光共聚焦显微镜观察探针在 U87MG 细胞中的定位：CQSC6 因烷基链较短（6 个碳），膜靶向性差；CQSC8 与 CQSC10 因适宜长烷基链，能特异性标记细胞膜，且荧光信号集中于细胞膜区域，无明显胞内扩散，验证了膜靶向设计的有效性。在胆固醇耗竭引发的膜极性变化研究中，用甲基 -β- 环糊精（MβCD）耗竭 U87MG 细胞的细胞膜胆固醇后，CQSC8 和 CQSC10 的荧光寿命显著延长：CQSC8 从 15.2 ns 延长至 18.3 ns（Δτ=3.1 ns），CQSC10 从 16.9 ns 延长至 20.2 ns（Δτ=3.3 ns），统计结果也直观呈现了这种寿命差异，证明探针对胆固醇调控的膜极性变化具有高敏感性，可用于解析脂筏相关膜微域的结构功能。在细胞迁移过程的膜极性动态追踪中，以 CQSC10 标记 U87MG 细胞，通过划痕实验观察迁移过程：随时间推移（0-20 min），细胞迁移边缘与中心区域的荧光寿命差异逐渐显著，定量统计和相量分析进一步佐证了这一动态变化；动态成像及相量图则清晰展示了细胞迁移时膜极性的不对称分布与时间依赖性演变，说明探针可实时捕捉细胞生理过程中膜微环境的异质性动态，为研究细胞迁移（如肿瘤转移）的膜机制提供了可视化手段。该系列探针凭借对膜极性的高敏感性和动态追踪能力，能够精准解析胆固醇代谢、细胞迁移等过程中的细胞膜异质性，为细胞膜功能微域的研究提供了有力工具。
结论
本文设计的基于喹吖啶酮荧光团的 CMFL-QASAG 系列探针（含 CQSC6、CQSC8、CQSC10），凭借超长荧光寿命（细胞膜内达 16-20 ns）、高量子产率（DMSO 中约 90%）及极性敏感性，结合磺酸基 - 长烷基链的膜靶向设计，在活细胞体系中展现出优异性能：通过荧光寿命成像（FLIM）技术，该探针可精准捕捉胆固醇耗竭（经 MβCD 处理后，CQSC8 和 CQSC10 寿命分别延长 3.1 ns、3.3 ns）引发的膜极性变化，实时追踪细胞迁移过程中膜异质性的动态演变（迁移边缘与中心区域寿命差异显著），并依据膜极性差异（与磷脂组成相关）实现正常细胞与肿瘤细胞（如 MCF-10A 与 U87MG）的有效区分；同时，其良好的生物相容性（10-50 μM 浓度下对 U87MG 细胞存活率无影响）与膜靶向特异性（CQSC8、CQSC10 因适宜烷基链长度实现精准膜定位），为解析细胞膜脂筏微域、细胞骨架重排等生理过程的膜异质性机制提供了关键工具，
参考文献
Developing Quinacridone-Based Long Fluorescent Lifetime Probesfor Cell Membrane Heterogeneity lmaging，Tong Wu, Yifan Liu, Fei Yuan, Zhiyang An, Xiaoling Zhang*, and JingJing*，Anal.Chem.2025,97,23251−23259，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c03649
