行业文献

内容提要

   本研究设计了四种具有扩展疏水烷基链的两亲性七甲基花菁(IR780-NC_n，n = 3/6/12/18。通过研究染料的最佳性能和形态，最终优化了IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈两种可形成非荧光纳米染料聚集在PBS中，但分解并恢复强烈的NIR辐射疏水介质中的发射。在细胞摄取后，两亲性菁氨酸在细胞膜细胞器如线粒体(IR780-NC₃和IR780-NC₆))或细胞膜(IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈))中显示荧光。此外，在IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈中观察到，疏水屏蔽增强了激光照射下ROS的生成_。在体内，IR780-NC₁₈给药(i.v.)显示出最亮和最长的肿瘤荧光长达96小时。在肿瘤NIR图像的指导下，IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈光疗证实了有效的PTT/PDT抗肿瘤作用。

结果与讨论

光敏剂设计与光物理性质研究

   对两个吲哚环进行修饰，合成了一系列不对称的七甲基菁胺。首先，的目标是通过在其中一条n -烷基侧链上引入季铵来提高菁氨酸的亲水性。然后，通过将不同长度(n = 3、6、12和18)的烷基链连接到另一个吲哚环来调节疏水性。因此，四种菁氨酸(IR780-NC₃，IR780-NC₆，IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈)。

光敏剂的光化学特性。

   在DMSO中，4种菁氨酸的紫外吸收峰均在794 nm处，最大荧光发射波长约为820 nm。但随着烷基链的延长，其吸收强度和荧光强度略有增加。在794和808 nm处的摩尔吸收系数，以及四种花青素的荧光量子产率依次增大:IR780-NC₁₈> IR780-NC₁₂> IR780-NC₆> IR780-NC₃，说明烷基链的延伸不影响吸收峰的波长，但增强了荧光强度。在PBS中，IR780-NC₃和IR780-NC₆在794 nm处的吸光度下降，在800 ~ 820 nm处的荧光强度下降，而更疏水的IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈在吸收光谱中表现出明显的蓝移，荧光发射几乎可以忽略不计。在DMSO中，随着IR780-NC_n烷基链的延长，4种染料的荧光略有增强。IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈的荧光量子产率分别为15.2%和17.1%。更重要的是，IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈在DMSO中与PBS中相比，每种染料在近红外范围内的荧光强度之比分别高达70.79和95.25，比IR780-NC₃和IR780-NC₆高出约20倍。为了研究染料的自组装行为与亲水性之间的关系，利用透射电镜(TEM)分析了四种花青素在PBS中的形态。随着烷基链从IR780-NC₃延伸到IR780-NC₁₈，菁氨酸倾向于组装成球形和更大的纳米颗粒。IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈的组装尺寸约为40 - 60 nm，这是通过EPR效应进行体内肿瘤成像的理想尺寸。在含有10% FBS的PBS中，IR780-NC₃、IR780-NC₆、IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈的zeta电位分别为-8.7、-13.6、-12.3和-19.5 mV。同时，使用Molinspiration在线软件计算了每种花青素的logP值随着烷基链从−C3H7到−C18H37的变化，四种染料的clogP值分别为2.13、3.7、6.73和9.02，表明菁氨酸变得更疏水。因此，可以通过控制染料的疏水性来调节菁氨酸π−π堆叠形成的纳米颗粒的大小。在辐照下，从激发态三态以非辐射衰变方式发射的七甲基菁的电子可以产生¹O₂或通过内部转换产生热效应。808 nm激光照射后，染料在DMSO中的温度(10 μM)在10 min内升高了约12℃，染料的光热转换效率(PCE)在25%左右，表现出较高的PTT效应。然后，用9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)检测¹O₂的生成。在808 nm激光照射10 min下，ABDA的吸光度在5μM IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈溶液下降明显，但在IR780-NC₃和IR780-NC₆溶液中更稳定。以亚甲基蓝(MB)为标准(ΦΔ = 52%)， IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈的单重态氧量子产率(ΦΔ)分别为9.5%和15.2%这可能是因为具有较长烷基链的IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈在水溶液中更容易受到π−π堆积相互作用的影响，从而导致较弱的荧光，但通过非辐射衰变产生较大的能量耗散，从而导致更高的PTT和PDT效率。

细胞共定位与光疗研究。

   人们发现适当微调探针的亲水性甚至可以调节细胞器的积累。利用CLSM成像技术在HeLa和HepG2细胞中通过荧光成像评估了四种花青素染料的亚细胞定位。在HeLa细胞中，IR780-NC₃和IR780-NC₆的红色荧光与Mito-Tracker green (MTG)的绿色荧光有很好的共定位。相比之下，IR780-NC₁₂与MTG的共定位较少，IR780-NC₁₈的MTG靶向性最差，但与膜荧光探针(DiO)的重叠效果最好。IR780-NC₁₂表现出适度的细胞膜靶向性，而IR780-NC₃和IR780-NC₆几乎不能在膜上积累。在HepG2细胞中也观察到同样的趋势。这些结果表明，四种两亲性菁氨酸可以有效地与线粒体或细胞膜相互作用，疏水性的增加增强了菁氨酸染料对细胞膜的靶向性。有趣的是，四种染料在细胞中的荧光强度与DMSO中的顺序相同:IR780-NC₁₈> IR780-NC₁₂> IR780-NC₆> IR780-NC₃，这证实了花菁纳米颗粒的“开启”细胞成像。然后，使用MTT法检测四种花青素染料的细胞毒性和光疗效果。4T1和HeLa细胞与5 μM染料共孵育24 h后的细胞存活率在90%左右，与10 μM染料共孵育24 h后的细胞存活率在60%以上，表明菁氨酸具有较低的细胞毒性。激光照射5min (808 nm, 0.5 Wcm⁻²)后，4T1细胞的存活率降至30%左右，提示花菁染料(5 μM)介导了有效的光疗。然后，使用2,7-二氯荧光素二醋酸酯(DCFH-DA)来评估4T1细胞内ROS的产生。只有激光处理IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈，在激光照射(0.5 Wcm⁻²，5 min)后，细胞中才会出现明显的DCF荧光，说明激光激活后两种疏水菁更容易在细胞中产生ROS。

活体成像与抗肿瘤光疗。

   通过静脉注射探索了四种花青素对4T1荷瘤小鼠的肿瘤靶向性，并分析了注射后1 h的体内成像。IR780-NC₃和IR780-NC₆的体内荧光较弱，随着时间延长至96 h，荧光逐渐减弱。对于IR780-NC₁₂，虽然肿瘤部位的荧光不那么亮，但在注射后5 - 24 h内荧光保持不变。对于IR780-NC₁₈，随着时间延长至96 h，肿瘤部位的荧光逐渐增强。为了观察染料在小鼠体内的分布，分别在24、48、96 h解剖小鼠的主要器官和肿瘤组织注射。IR780-NC₃和IR780-NC₆的荧光在24 h内主要分布在肝脏和肾脏，IR780-NC₁₈的肿瘤强度在注射后24 h达到最高，并在24 - 96 h的观察期内一直保持较强，这可能是因为亲水的IR780-NC₃和IR780-NC₆形成较小而疏水性的IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈形成了更大的纳米颗粒(约50 nm)，可以更有效地通过EPR效应靶向肿瘤。此外，大于50 nm的IR780-NC₁₈纳米颗粒容易在肿瘤中积累。这些结果表明，调节烷基侧链上菁氨酸的疏水性可以调节自聚集纳米颗粒的大小，从而促进肿瘤的蓄积。

   考虑到IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈具有优越的肿瘤靶向和ROS生成能力，将荷瘤小鼠分为6组(n = 5)，当肿瘤大小达到100 mm³，重点研究其抗肿瘤光疗作用。各组小鼠分别静脉注射PBS (100 μL)、IR780-NC₁₂(100 μM)或IR780-NC₁₈(100 μM)。随后，在24和48 h用808 nm激光(1 Wcm⁻²，10 min)照射肿瘤部位。该治疗方案重复3个周期。通过红外热像仪，记录到IR780-NC₁₂+激光组和IR780-NC₁₈+激光组的肿瘤温度明显更高。不同的是，在IR780-NC₁₂+激光组中，在第一个光疗周期中，肿瘤温度在注射后24小时没有明显变化，但在随后的照射中升高到50 - 55℃。在IR780-NC₁₈+激光组中，整个治疗过程中肿瘤温度始终保持在50 ~ 55℃左右。IR780-NC₁₂+激光组和IR780-NC₁₈+激光组的肿瘤生长受到的抑制比其他组更明显。治疗后，IR780-NC₁₂+激光组和IR780-NC₁₈+激光组肿瘤大小最小。这些结果表明，疏水IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈在肿瘤部位有效积累，对肿瘤生长具有有效的光疗作用。

结论

   为了开发具有高对比度肿瘤图像的荧光“开启”菁氨酸，提出了一种简单的设计，通过调节疏水性来控制两亲性七甲基菁氨酸(IR780-NCn)的自组装行为。四种染料中，IR780-NC₃和IR780-NC₆在水溶液中具有荧光，而IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈作为聚集体几乎没有荧光。在细胞中，疏水的IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈以明亮的荧光靶向细胞膜。在体内，IR780-NC₁₈纳米颗粒可以通过EPR效应特异性靶向肿瘤。同时，IR780-NC₁₂和IR780-NC₁₈由于受到长烷基链和π−π堆积的保护，能够更有效地产生ROS，从而对荷瘤小鼠发挥PTT/PDT联合治疗作用。

参考文献

Controllable Self-Assembly of Amphiphilic Heptamethine Cyanines for Turn-On Fluorescence-Guided Tumor Phototherapy，Yan Ma, Mengfan Han, Yingrui Su, Yongmei Yin, Xiujie Zhao,* Rimo Xi,* and Meng Meng*，Anal. Chem.，2025, 97, 25223–25231，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c04731