内容提要
本文提出一种 “平面核心 + 扭曲外围” 的分子设计策略，开发出 NIR-II 光热治疗剂 4TPE-TB。该分子具有共平面中心核心以增强分子内共轭，同时搭载四个高度扭曲的外围转子以抑制不利的分子间堆积。4TPE-TB 表现出高摩尔吸光系数、长波长激发（980 nm）以及优异的荧光和光热性能，优于采用以往分子策略合成的类似物。通过将 4TPE-TB 制备成纳米颗粒（NPs），我们在癌症模型中成功实现了高精度 NIR-II 荧光成像和高效光热治疗。该纳米颗粒兼具直接肿瘤消融和免疫系统激活的双重作用，凸显其作为强力癌症治疗平台的潜力。
结果与讨论
分子设计原理与光物理性质
我们选择苯并 [1,2-c:4,5-c′] 双 ([1,2,5] 噻二唑)（BBT）作为稳定的缺电子单元，同时引入烷氧基取代的 TPE 基团作为给电子单元。参考以往分子设计，我们合成了两种参照分子 2TPE-oTB 和 2TPE-mTB，二者均通过十二烷基噻吩 π 桥连接两个 TPE 单元，且烷基链分别位于邻位和间位取代位点。已知 2TPE-oTB 中噻吩环邻位的烷基链会向中心核心内侧延伸，产生显著的空间位阻，导致分子几何结构高度扭曲。这种扭曲构象虽能减少 π-π 相互作用、促进 AIE 行为，但会破坏共轭作用，导致吸收蓝移和摩尔吸光系数降低，最终限制其在 NIR 激发下的光热和荧光性能。相比之下，2TPE-mTB 的烷基链移至间位后，空间位阻减小，分子几何结构更趋共平面，共轭作用增强，吸收和发射波长红移；但平面性的增加会促进分子间堆积，导致 NIR-II 荧光猝灭，从而损害成像性能。为解决上述两种设计的权衡问题，我们提出 “平面核心 + 扭曲外围” 的分子工程策略，开发了 4TPE-TB 分子：中心核心保持平面结构，以确保高效的分子内电荷转移（ICT）和强光吸收；外围片段则设计为扭曲结构，以抑制紧密的分子间堆积、防止荧光猝灭。所有化合物均表现出显著的电荷转移吸收峰，且吸收尾端延伸至 NIR 区域：其中 2TPE-oTB 的吸收蓝移最显著，最大吸收峰位于 669 nm，2TPE-mTB 的吸收光谱显著红移，最大吸收峰位于 809 nm，4TPE-TB 的吸收红移最显著，最大吸收峰位于 813 nm，吸收尾端超过 1000 nm。2TPE-oTB、2TPE-mTB 和 4TPE-TB 的荧光光谱显示，三者的最大发射峰分别位于 975 nm、999 nm 和 1003 nm，这一趋势与吸收光谱一致。有趣的是，与 2TPE-oTB 相比，2TPE-mTB 和 4TPE-TB 的吸收和荧光光谱几乎重叠，且波长红移、斯托克斯位移（Δλ）更小。4TPE-TB 确实具有更优异的光物理性质，包括更高的摩尔吸光系数和更长的激发 / 发射波长，这有助于改善激发态能量的 “上游过程”。
为提高上述光热治疗剂的生物相容性和靶向效率，我们采用具有可后修饰马来酰亚胺（Mal）基团的两亲性共聚物 DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal 作为包封基质，制备纳米颗粒NPs—— 马来酰亚胺基团可通过点击化学实现后修饰。为增强肿瘤精准追踪能力，我们通过点击反应在纳米颗粒表面修饰了环肽 RGD（cRGD）—— 已知 cRGD 对肿瘤细胞过表达的整合素受体具有高亲和力。[47] 4TPE-TB 纳米颗粒的肿瘤靶向能力源于 “增强渗透滞留（EPR）效应” 与 “cRGD 介导的整合素受体识别” 的协同作用（肿瘤细胞中整合素受体上调）。动态光散射（DLS）结果显示，制备的 2TPE-oTB NPs、2TPE-mTB NPs 和 4TPE-TB NPs 的平均水动力学直径分别为 116 nm、91 nm 和 93 nm，且多分散指数（PDI）均小于 0.2，表明粒径分布均一（透射电子显微镜 TEM 结果进一步验证）。为评估纳米颗粒的稳定性，我们监测了其在磷酸盐缓冲液（PBS）中水力直径的时间变化：三种纳米颗粒的平均粒径在一个月内保持稳定，表明其在生理条件下具有优异的稳定性。我们随后评估了纳米颗粒的吸收和发射特性：三种纳米颗粒的吸收峰均较其溶液状态红移，其中 2TPE-oTB NPs、2TPE-mTB NPs 和 4TPE-TB NPs 的最大吸收峰分别位于 698 nm、829 nm 和 855 nm—— 这一现象源于纳米颗粒内部增强的分子间 π-π 堆积。值得注意的是，2TPE-mTB NPs 和 4TPE-TB NPs 在 808 nm 和 980 nm 处均有吸收，而 2TPE-oTB NPs 对 980 nm 激发无响应。荧光光谱进一步显示，与 2TPE-oTB NPs（976 nm）相比，2TPE-mTB NPs 和 4TPE-TB NPs 的发射波长红移至 NIR-II 窗口（分别为 1102 nm 和 1037 nm）。尤其值得注意的是，4TPE-TB NPs 的荧光信号显著高于 2TPE-mTB NPs，这表明其聚集状态下具有抗荧光猝灭能力—— 这得益于 4TPE-TB 的扭曲外围结构，该结构抑制了分子间堆积。除荧光量子产率Φ外，纳米颗粒的吸收特性也是影响 NIR-II 亮度的重要因素。显示了三种纳米颗粒（0.1 mg/mL）在 980 nm 激发下的荧光亮度（定义为 Φ 与该波长下吸光度（A₉₈₀）的乘积）：4TPE-TB NPs 的 NIR-II 荧光亮度最高，分别是 2TPE-mTB NPs 的 6 倍、2TPE-oTB NPs 的 23 倍。因此，尽管 4TPE-TB 的 Φ 处于中等水平，但其高摩尔吸光系数和宽吸收范围使其适合 NIR-II 成像。通过监测激光照射下的温度变化，评估了纳米颗粒的光热性能：在 808 nm 激光（0.8 W/cm²）照射下，2TPE-oTB 纳米颗粒的温度升高幅度最小；而 2TPE-mTB 纳米颗粒和 4TPE-TB 纳米颗粒则快速显著升温，3 分钟内温度即超过 80℃，表明其具有高效的光热转换能力。此外，在 808 nm 激光照射下经过 5 次连续加热 - 冷却循环后，纳米颗粒的性能仍保持稳定，无显著降解，表明其具有优异的热稳定性。计算得出 4TPE-TB 纳米颗粒的光热转换效率（PCE）为 50%，这可能归因于四个 TPE 单元带来的强烈分子内运动。需注意的是，PCE 并非评估光热性能的唯一指标 ——4TPE-TB 纳米颗粒的高吸收特性为通过非辐射跃迁产热提供了充足的激发态能量。总体而言，4TPE-TB 纳米颗粒在增强长波长吸收、提高 NIR-II 亮度和高效光热转换方面表现出综合优势，优于其他两种纳米颗粒。这些结果证实，我们的分子设计可有效调控 NIR-II 材料激发态能量的上游和下游过程，使 4TPE-TB 纳米颗粒成为极具潜力的多模态应用候选材料。
体外细胞毒性评估与细胞成像
利用 4TPE-TB 纳米颗粒的荧光和光热特性，我们探索了其在癌症治疗中的应用。首先，通过荧光追踪纳米颗粒被肿瘤细胞的摄取过程： 4TPE-TB 纳米颗粒与 4T1 细胞共孵育 4 小时后，大量颗粒在细胞内积累，且主要定位于细胞质。为评估 4TPE-TB 纳米颗粒的生物相容性，我们进行了体外细胞毒性研究和细胞成像：结果显示，在黑暗条件下，即使纳米颗粒浓度高达 50 μg/mL，其细胞毒性也可忽略不计；而在 808 nm 激光（1 W/cm²）照射下，24 小时后细胞存活率随浓度增加而降低，当浓度为 20 μg/mL 时，细胞存活率几乎降至 0。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察碘化丙啶（PI）和钙黄绿素 AM（Calcein AM）标记的 4T1 细胞，进一步验证了上述结果：在仅加入 4TPE-TB 纳米颗粒的组中，细胞保持强绿色荧光，表明黑暗条件下纳米颗粒无毒性；而经激光（808 nm，1 W/cm²，10 分钟）处理的细胞，24 小时后呈现红色荧光，表明 4TPE-TB 纳米颗粒的光热效应导致显著细胞死亡。无纳米颗粒的对照实验显示，激光对细胞存活率几乎无影响，进一步证实了 4TPE-TB 纳米颗粒优异的光热治疗（PTT）效果。流式细胞术分析进一步证实了 4TPE-TB 纳米颗粒通过 PTT 诱导癌细胞凋亡的光毒性：4TPE-TB 纳米颗粒介导的 PTT 可诱导肿瘤细胞早期凋亡（Q3 象限），经纳米颗粒 + 激光处理（4TPE-NPs + L 组）6 小时后，细胞总凋亡率（Q2+Q3 象限）高达 84.43%；而 PBS 组、PBS + 激光组（PBS + L）和仅纳米颗粒组（4TPE-TB NPs）的凋亡或坏死率均极低。这些体外细胞实验共同表明，4TPE-TB 纳米颗粒具有优异的生物相容性和强效的光热杀伤癌细胞能力。
980 nm 激发下的体外与体内第二近红外区成像
利用体内成像系统（IVIS），以 ICG 为参照，评估了纳米颗粒的 NIR-II 成像性能。为实现更深层成像，采用 980 nm 激发激光 —— 该波长具有更好的组织穿透性，且 4TPE-TB 在该波长下具有良好的吸收特性。使用 1300 nm 长通滤光片（LP1300）检测时，仅 2TPE-mTB 纳米颗粒和 4TPE-TB 纳米颗粒表现出可检测的荧光，而 2TPE-oTB 纳米颗粒和 ICG 在相同条件下几乎无荧光，这与之前计算的纳米颗粒 NIR-II 亮度一致。定量荧光强度分析显示，4TPE-TB 纳米颗粒的荧光强度随浓度（0.05-0.4 mg/mL）增加而呈浓度依赖性升高，表明其在生理环境中具有优异的荧光特性。除亮度外，空间分辨率和穿透深度也是荧光成像（FLI）的关键评估指标。因此，我们以脂肪乳剂为组织模拟介质，在 0-4 mm 深度范围内评估了纳米颗粒的成像深度：将 4TPE-TB 纳米颗粒和 ICG 分散于小鼠血清中，装入玻璃毛细管，然后浸入不同厚度的脂肪乳剂中。结果显示，4TPE-TB 纳米颗粒可实现玻璃毛细管的高保真成像，而即使在无脂肪乳剂覆盖（0 mm）的情况下，ICG 组也几乎无荧光信号。定量结果进一步证实，4TPE-TB 纳米颗粒在组织厚度达 3 mm 时仍能保留荧光信号。基于体外优异的穿透深度结果，我们以 BALB/c 雌性裸鼠为模型，探索了 4TPE-TB 纳米颗粒的体内荧光血管造影潜力：静脉注射 200 μL 4TPE-TB 纳米颗粒（1 mg/mL）后，在 980 nm 激光照射下进行成像。显示，成功实现了 NIR-II 血管造影，可清晰观察到小鼠腹部血管，并从血管造影图像中测得血管直径约为 0.17 mm 和 0.15 mm。值得注意的是，4TPE-TB 纳米颗粒优异的穿透深度使其能够清晰成像盲肠结构；此外，肠浆膜上的血管结构显示出四个明显的荧光峰，对应血管分支直径分别为 0.18 mm、0.13 mm、0.20 mm 和 0.16 mm。这些结果表明，4TPE-TB 纳米颗粒可实现高分辨率微血管成像。为评估 4TPE-TB 纳米颗粒的肿瘤追踪潜力，我们以 4T1 荷瘤小鼠为模型进行体内成像：静脉注射 4TPE-TB 纳米颗粒后 12 小时，肿瘤部位出现明亮的荧光信号；24 小时时荧光强度达到峰值，信背比高，肿瘤边界清晰；值得注意的是，注射后 72 小时内，肿瘤部位仍可检测到强荧光信号，表明纳米颗粒在肿瘤中滞留时间长且积累稳定。为证实 4TPE-TB 纳米颗粒在肿瘤中的特异性积累，我们在注射 72 小时后处死小鼠，收集肿瘤及主要器官进行荧光成像：结果显示，肿瘤组织的 NIR-II 荧光强度显著高于其他器官。这些发现凸显了 4TPE-TB 纳米颗粒卓越的肿瘤靶向能力、积累效率以及优异的 NIR-II 成像性能。
体内光治疗效果
以 4T1 荷瘤小鼠为模型，验证了 4TPE-TB 纳米颗粒的体内抗癌潜力和光治疗效果。首先通过光热成像（PTI）记录激光照射下肿瘤温度变化，评估其光热性能：静脉注射 4TPE-TB 纳米颗粒（1 mg/mL，200 μL）的小鼠，在 808 nm 激光（1 W/cm²）照射下，肿瘤温度 1 分钟内快速升高至 50℃以上，5 分钟内达到约 60℃；而 PBS + 激光组（PBS + L）的肿瘤温度几乎无变化。这些结果表明，4TPE-TB 纳米颗粒可有效在肿瘤部位积累，并在激光照射下产生足够热量，诱导肿瘤热疗。进一步评估了 4TPE-TB 纳米颗粒的抗肿瘤效果：给小鼠尾静脉单次注射 4TPE-TB 纳米颗粒；激光处理组（4TPE-TB NPs + L 和 PBS + L）在整个治疗周期的前 3 天内接受 3 次 808 nm 激光照射；在 15 天内每 2 天测量一次肿瘤大小，评估治疗效果。与其他治疗组相比，4TPE-TB NPs + L 组的肿瘤生长受到显著抑制；值得注意的是，该组肿瘤在 5 天内完全消融，且在后续 10 天内无复发迹象；而 PBS 组、PBS + L 组和 4TPE-TB NPs 组的肿瘤则持续生长，未受到明显抑制。
结论
我们提出 “平面核心 + 扭曲外围” 的分子设计策略，构建了 NIR-II 光热治疗剂 4TPE-TB，解决了激发态能量上游和下游过程面临的挑战。4TPE-TB 的设计核心基于两大原则：一是 “上游拓展”—— 通过分子中心框架平面化增强分子内共轭，实现更长波长激发和更高光子吸收；二是 “下游调控”—— 在分子外围引入多个扭曲 TPE 单元，减少分子间堆积，防止聚集导致的荧光猝灭，同时保留分子内运动以实现高效光热转换。4TPE-TB 纳米颗粒实现了增强的长波长光子吸收，同时平衡了荧光发射和光热转换能力，可用于高分辨率 NIR-II 荧光成像（FLI）和高效癌症光热治疗（PTT）。此外，4TPE-TB 纳米颗粒还能启动全身性免疫应答，产生持久的抗肿瘤免疫。本研究为设计具有优化激发态能量输入与输出的高性能 NIR-II 光热治疗剂提供了简便有效的方法；所提出的策略为实现 NIR-II FLI 和 PTT 提供了多功能平台，有望推动多模态成像引导光热系统向临床转化。
参考文献
Harnessing Synergistic Interplay of Twisted and Planar Structures for the Development of NIR-II Phototheranostic Agents,Huilin Xie,Wenjing Liu, Shibo Cheng, Ying Peng, Rufan Mo, Rongyuan Zhang, Junyi Cai, Peikun Xin, Zhen Tian, Ryan T. K. Kwok, Jacky W. Y. Lam, Feng Xu,* Guorui Jin,* Jianquan Zhang,* and Ben Zhong Tang*, ACS Nano.2025,c04254，https://doi.org/10.1021/acsnano.5c04254
