内容提要
我们报道了新型基于苯并双（1,2,5-噻二唑）的第二近红外区（NIR-II）荧光团HY1-HY4，它们具有高度扭曲的结构（在S0态时为55°）、极强的聚集诱导发光（AIE）特性，在水溶液中，其在NIR-II区（>1000 nm）的荧光量子产率（QYs）高达14.45%，在近红外IIb窗口（NIR-IIb，>1500 nm）约为0.27%。利用NIR-IIb AIE HY4点，首次实现了血管再生和溶栓的高分辨率NIR-IIb荧光成像，以及中药灯盏细辛注射液（DXI）对缺血性卒中治疗效果的实时反馈。此外，结果表明DXI通过血管生成途径对脑缺血损伤具有神经保护作用。
HY1–HY4的设计、合成与表征
我们成功构建了四种基于BBTD的荧光团，即HY1–HY4，它们以BPN作为电子给体，3,4-双（烷氧基）噻吩环作为π-间隔基，同时包含另一个电子给体。值得注意的是，与广泛使用的三苯胺给体单元相比，BPN中的萘基有助于荧光团形成扭曲结构，从而实现更高的荧光增强。此外，与HY1–HY3相比，噻吩上的2-乙基己氧基降低了HY4的π-π堆积，并促进了分子内运动。我们以化合物1a–4a为原料，通过连续的Stille偶联、锌粉诱导还原、N-亚硫酰苯胺（PhNSO）诱导关环以及Suzuki偶联反应，成功合成了基于BBTD的荧光团HY1–HY4。HY1-HY4的最大吸收峰分别约为772、735、736和736纳米，相应的最大发射峰分别约为1080、1034、1058和1036纳米。HY1-HY4在四氢呋喃中的量子产率（QY）值分别约为0.99%、0.66%、3.4%和2.82%（QYIR-26=0.5%）。通过分析HY1-HY4在水/四氢呋喃混合体系中随着水体积分数（fw）增加而产生的聚集诱导发光（AIE）效应发现，在水/四氢呋喃混合溶液（水体积分数为90%）中，HY2-HY4的荧光强度明显强于HY1，而HY1的荧光强度极弱。为了研究HY1-HY4的聚集诱导发光特征，我们在808纳米激发下，使用不同的水体积分数测量了荧光发射光谱。结果表明，随着水体积分数从0%逐渐增加到40%，HY2-HY4的荧光强度比（I/I0）逐渐降低；当水体积分数从40%增加到90%时，荧光强度比则急剧上升，这证实了典型的聚集诱导发光效应。值得注意的是，HY4的荧光强度比达到13，远高于HY3（荧光强度比=9）和HY2（荧光强度比=3）。
HY1-HY4点的制备与表征
采用DSPE-PEG3.4k通过纳米沉淀法制备了水溶性HY1–HY4点。透射电子显微镜（TEM）图像显示，所获得的点的平均粒径约为80 nm，而动态光散射（DLS）显示其水合直径约为100 nm。水中的HY4点的Zeta电位为-11.8 eV，包封率约为85%。水中HY1–HY4点的紫外-可见-近红外光谱在740–770 nm处有吸收峰，而在808 nm激光激发下，荧光发射光谱显示发射峰集中在1020–1090 nm处，信号范围为900–1600 nm。水溶液中的HY1–HY4点的量子产率（QY）值分别约为0.27%、1.68%、12.69%和14.45%。相比之下，水中的HY1–HY4点相对于四氢呋喃中的分子荧光团的量子产率比分别为0.27、2.54、3.73和5.12，这与它们的聚集诱导发光（AIE）特性非常匹配。水中HY4点的摩尔消光系数（ε）为8707 L·mol-1·cm-1。在相同浓度下，进一步比较了水溶液中HY4点与吲哚菁绿（ICG，水溶液）和IR-26（在二氯乙烷（DCE）中）的亮度。值得注意的是，HY4点的荧光强度分别约为ICG和IR-26的7.5倍和6倍。最重要的是，水溶液中HY4点在1500 nm波长以上的量子产率约为0.27%，远高于先前报道的有机荧光团HL3点（0.05%）45和2TT-oC26B纳米颗粒（0.12%）。此外，在808 nm激光照射下，HY4点在水和血浆中表现出优异的光稳定性，而在相同的测量条件下，ICG的荧光强度显著降低。通过荧光强度分析测得HY4点在血液中的半衰期约为114分钟。接下来，我们通过CCK-8测定法评估了HY4点对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和脑微血管内皮细胞（bEnd.3）的细胞毒性，发现即使在浓度高达200 μg/mL时，也没有显著的细胞毒性。此外，还评估了给癌症研究所（ICR）小鼠施用HY4点的安全性。使用ASTM E2524-08标准测试测量HY4点的溶血特性。结果表明，在浓度高达100 μg/mL时，HY4点没有可检测到的溶血特性。通过以5 mg/mL的浓度静脉注射（i.v.）HY4点给ICR小鼠后30天，评估其生理毒性。在HY4点处理的动物和磷酸盐缓冲盐水组之间，血液生化标志物水平（包括碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、血尿素氮、血清肌酐和总胆红素）没有统计学上的显著差异。此外，我们发现HY4点处理的小鼠的心脏、肝脏、肾脏、肺和脾脏的病变与对照组相比没有可观察到的差异。
后肢血管和皮下肿瘤的近红外-IIb荧光成像
将HY4点（0.2mL，1g/L）静脉注射到正常Balb/c小鼠体内。静脉注射后，立即在808纳米激光激发（1000、1250、1320和1500纳米长通滤光片）下研究通过血流传播的近红外-IIb信号。在1500纳米长通滤光片下，注射HY4点40秒后，小鼠全身血管和后肢微血管清晰可见。1500纳米长通滤光片下血管（红色虚线）的半高全宽（FWHM）经计算约为117微米。为进行活体近红外-IIb肿瘤血管成像，将HY4点（0.2mL，1mg/mL）静脉注射到携带CT-26肿瘤的小鼠体内，并在808纳米激光照射下，使用1500纳米长通滤光片立即进行CT-26荷瘤肿瘤血管成像。在1500纳米长通滤光片下，半高全宽值约为70.9微米（红色虚线）时，肿瘤血管可明显识别。HY4点的超高亮度显示出快速的宽场采集速率，有助于高分辨率成像更高阶的血管分支。
外周缺血性疾病的近红外-IIb成像
通过结扎股静脉和股动脉建立了缺血性后肢小鼠模型。随后，将HY4点静脉注射（200μL，0.8 mg/mL）到后肢缺血小鼠体内（每组n=3）。在近红外-IIb成像（1500 nm长通，95 mW/cm²，808 nm激发，200 ms）中，静脉注射HY4点后不久，与后肢血管正常侧相比，股动脉和股静脉中的血流明显不连续，这表明其具有监测血管阻塞的潜力。为了评估体内病理性循环系统的功能障碍，研究人员使用FeCl₃在股动静脉和腹部静脉中生成单侧血栓。60 向FeCl₃诱导的C57BL/6小鼠静脉注射HY4点（0.2 mL，0.8 mg/mL）后不久，通过近红外-IIb荧光成像（1500 nm长通，808 nm，95 mW/cm²，200 ms）观察到，与后肢血管的正常侧相比，股动静脉血流出现明显中断。61 值得注意的是，通过手术发现，血流中断的位置与血栓位置精确匹配。同时，在808 nm激光激发（95 mW/cm²）下，使用不同的长通滤光片（1000、1250、1320和1500 nm）也可观察到腹部血管的主要类似缺损信号。近红外-IIb荧光成像（1500 nm长通，信噪比=7.4）的信噪比是近红外-II荧光成像（1000 nm长通，信噪比=1.5）的4.9倍，也是近红外-IIa荧光成像（1320 nm长通，信噪比=4.2）的1.8倍。考虑到近红外-IIb荧光成像具有高灵敏度，能快速反馈血流动力学过程，因此可以实现对动脉和静脉循环中血栓形成的评估。在无创血流动力学以及排列整齐的血管分支的高分辨率的鼓舞下，我们通过检测动态血流过程，展示了近红外-IIb（NIR-IIb）荧光成像的巨大潜力。为了分析股动脉的血管再生现象，我们将HY4点（0.2mL，0.8mg/mL）静脉注射到PAD小鼠模型的不完全后肢缺血手术中（每组n=3）。注射后5分钟，股动脉闭塞部位周围的荧光强度与对侧后肢血管相比显著降低。为了应对缺血刺激，我们在手术后向PAD模型静脉注射HY4点（0.2mL，0.8mg/mL），监测小鼠后肢血管重建的演变（每组n=3）。在股动脉手术切除后的第5天，在1500纳米长通滤光片下，可以清晰地观察到缺血后肢上的大量再生血管。相比之下，未手术的血管结构保持不变。此外，NIR-IIb荧光成像提供了组织灌注信息，并量化了缺血后肢的微血管密度。
结论
我们通过分子调控开发了新型的基于BBTD的近红外二区荧光团，即HY1–HY4。其中，HY4展现出最大程度的扭曲结构（在S0态时为55.0°），且其聚集诱导发光（AIE）效应（I/I0 > 13）远强于其他荧光团。此外，封装后的HY4点在1500纳米以上的近红外-IIb区域实现了质量显著更高的成像（量子产率≈0.27%），同时还具备优异的水溶性、生物相容性和光稳定性。借助近红外-IIb成像技术，HY4点能够在体内可视化并持续实时监测中枢或外周血管相关疾病，如缺血性脑卒中、血栓、外周动脉疾病（PAD）和肿瘤血管生成。本研究首次证实，HY4点作为一种高效成像剂，在近红外-IIb亚窗口中用于检测缺血性脑卒中并指导药物治疗具有可行性。
参考文献
Small-Molecule Fluorophores for Near-Infrared IIb Imaging and Image-Guided Therapy of Vascular Diseases, Yang Li, Hua Zhu, Xiaobo Wang, Yan Cui, Lijuan Gu, Xiaowen Hou, Mengting Guan, Junzhu Wu, Yuling Xiao, Xiaoxing Xiong, Xianli Meng, Xuechuan Hong,CCS Chem. 2022, 4, 3735–3750，https://doi.org/10.31635/ccschem.022.202101547
