内容提要
本研究报道了一系列基于吩噻嗪/吩恶嗪小分子的免洗探针。用硝基对吩噻嗪/吩恶嗪进行简单的修饰可以显著增强其极性敏感特性，这非常适合于免清洗细胞成像。这些探针具有低分子量、优异的光稳定性和大的斯托克斯位移(高达191 nm)。通过与靶向基团的偶联，开发了一系列探针，无需任何洗涤步骤，即可在溶酶体、线粒体、内质网、脂滴和质膜等不同细胞器中进行特异性成像。此外，通过简单地将中心核中的S原子替换为O原子，探测器的发射从红色转变为绿色-黄色。使用这两个探头，可以实现高对比度、双色免洗成像。PXZ-Lipid探针被成功应用于实时监测活细胞内脂滴的动态变化
结果与讨论
探针的设计与合成
以吩噻嗪为电子给体，在芳环上引入强吸电子硝基，构建了供体-受体(D-A)结构的荧光团。此外，在吩噻嗪核心的两侧引入了硝基，以生成受体或供体-受体(A-D-A)型荧光团。为了实现有机靶向功能化，在氮原子上引入了与长烷基链相连的溴原子，成功地生成了中间体2a和2b。此外，在氮原子上引入叔丁氧基(Boc)导致了中间体3a和3b的合成，从而显著提高了探针对脂滴的亲和力。中间体2a/b和3a/b分别在四氢呋喃和甲醇溶胶孔中表现出相似的吸收强度。虽然荧光强度差别很大，但在非极性溶剂四氢呋喃中都有很强的发射，在极性溶剂甲醇中几乎没有发射。这证明了吩噻嗪类荧光团具有明显的溶致变色行为。大量研究表明，探针的亲水-疏水平衡在标记不同的亚细胞细胞器方面起着至关重要的作用。一般来说，具有高亲脂性的探针可以很容易地穿过质膜，随后聚集在特定的细胞器中，如溶酶体、线粒体、内质网和脂滴。相比之下，质膜靶向探针通常采用两亲性设计，其中疏水部分(例如，长烷基链)能够在脂质双层内插入和保留，而亲水性基团(例如，阳离子或阴离子取代基)保持暴露在水界面，以确保膜的定位。在这里，通过将细胞器靶向的部分偶联到苯硫锌荧光载体支架上，开发了一系列新型的极性敏感和细胞器特异性的荧光探针。含有十二烷基链的烷基磺酸盐连接到荧光团上，得到质膜靶向探针PTZ-Memb和PTZ2N-Memb。考虑到二乙胺在生理pH下的可逆质子化，将其用于构建溶酶体靶向探针(PTZ-lyso和PTZ2N-lyso)。线粒体靶向探针(PTZ-MITO和PTZ2N-MITO)包含一个三苯基膦(TPP)基团，通过与带负电荷的线粒体膜的静电相互作用在线粒体基质中积累。内质网(ER)靶向探针(PTZ-ER和PTZ2N-ER)用对甲苯磺胺部分官能化。引入形成PTZ-Lipid和PTZ2N-Lipid的Boc基团，不仅改善了荧光团的溶解性，而且增强了对脂滴的亲和力。
吩噻嗪类探针的光物理性质
在四氢呋喃(THF)溶液中记录了吩噻嗪类分子的紫外可见吸收光谱和光致发光光谱，研究了它们的光物理性质。PTZ-lyso、PTZ-Mito、PTZ-Memb、PTZ-ER和PTZ-Lipid的吸收光谱相似，最大吸收峰和发射峰分别位于424/613 nm、428/619 nm、427/607 nm、429/588 nm和423/610 nm。对于PTZ2N系列，除了PTZ2NMemb略有蓝移外，其最大吸收峰与PTZ相比发生了红移，PTZ2N-lyso、PTZ2N-Mito、PTZ2N-Memb、PTZ2N-ER和PTZ2N-Lipid的最大吸收峰分别位于435 nm、446 nm、422 nm、433 nm和435 nm。然而，与PTZ系列相比，PTZ2N系列的发射峰普遍蓝移，发射峰值分别位于600 nm、592 nm、605 nm、586 nm和606 nm。PTZ2N系列的蓝移现象可能是由于在激发态下位于吩噻嗪相对两侧的硝基的竞争效应，导致了给体和受体之间的分子内电荷转移(ICT)效应的分散。此外，在四氢呋喃中，所有分子都表现出从146 nm到191 nm的大的斯托克斯位移。为了评估吩噻嗪类分子的环境敏感性，我们记录了它们在不同极性的溶剂中的荧光光谱，包括甲苯、四氢呋喃、丙酮和甲醇。在相同的激发条件下，所有分子都表现出明显的溶剂变色效应：在低极性溶剂(甲苯)中荧光强度最高，在高极性溶剂(甲醇)中几乎完全猝灭。此外，随着溶剂极性的增加，最大发射峰出现红移。这些观察证实了这些分子的ICT性质，并证明了它们的极性敏感行为，使它们适合于免清洗活细胞成像。为了评价吩噻嗪类分子的细胞毒性和生物相容性，在黑暗条件下进行了细胞计数试剂盒Kit-8(CCK-8)检测。将不同浓度(1、2、4和8μM)的吩噻嗪分子与HeLa细胞孵育24 h，分析细胞存活率。结果表明，高浓度的线粒体靶向探针(PTZ-MITO和PTZ2N-MITO)显著降低细胞存活率。这种作用可能归因于阳离子线粒体部分和细胞膜阴离子成分之间的相互作用，导致膜损伤和细胞存活率下降。幸运的是，在1μM的工作浓度下，用这些探针处理的细胞存活率保持在80%以上，这表明它们适合于活体细胞成像。除线粒体靶向探针外，所有其他分子在测试浓度范围内(1-8μM)细胞存活率均在85%以上。此外，在450 nm LED灯的照射下，评估了PTZ/PTZ2N系列探针的光毒性。将这些探针与HeLa细胞在黑暗中孵育1h，然后照射30min，取出探针，换成新鲜的培养液，在黑暗中再培养8h。结果表明，从1μM到8μM，所有探针的细胞存活率均在85%以上，说明它们具有良好的生物相容性和低光毒性。
活细胞内细胞器的共聚焦成像
首先用商品化的细胞器特异性探针孵育HeLa细胞40min，然后用缓冲液洗涤三次以去除多余的染料。在老化前，将PTZ2N探针直接加入培养皿中，再孵育40min(膜探针为5min)，无需额外清洗。PTZ2N探针(红色通道)与商业细胞器靶向探针在HeLa细胞中显示出显著的共定位。Pr分别为：PTZ2NMito与Mitotracker-Green(0.96)，PTZ2N-ER与ERTracker-Green(0.93)，PTZ2N-lyso与Lysotracker-Green(0.92)，PTZ2N-Lipid与BODIPY 493/503(0.90)，PTZ2N-Memb与膜染料(0.84)。与非商品化细胞器探针相比，基于P11、PTZ2N的探针表现出较低的Pr，进一步证实了它们对目标细胞器具有良好的特异性和靶向性。研究表明，基于吩噻嗪的探针(PTZ-Mito、PTZ-ER、PTZ-lyso、PTZ-Lipid和PTZ-Memb)的红色荧光通道与商品细胞器探针的绿色通道高度重叠，Pr值在0.84到0.96之间，证实了它们良好的细胞器靶向性能。为了评价基于PTZ2N/PTZ的探针在连续激光激发下在活细胞中的光稳定性，选取了具有代表性的PTZ2N-MITO和PTZ-MITO，并与商用探针MitoTracker-Green进行了比较。与Mitotracker-Green相比，PTZ2NMito和PTZ-Mito在488 nm激光照射30min的HeLa细胞中表现出更强的耐光漂白能力。这种增强的光稳定性支持了基于PTZ2N/PTZ的探针适用于长期细胞成像应用。受到基于吩噻嗪的探针具有良好的光物理和细胞成像性能的鼓舞，我们接下来将这一策略应用于吩恶嗪，合成了探针PXZ-lyso、PXZ-Mito、PXZ-ER、PXZ Lipid、PXZ2N-ER和PXZ2N-Lipid。基于吩恶嗪的探针也表现出明显的极化敏感行为，荧光强度随着溶剂极性的降低而增强。此外，还在四氢呋喃中测量了吩恶嗪分子的UV-Vis吸收和光致发光光谱。PXZ-lyso、PXZ-Mito、PXZ-ER和PXZ-Lipid的最大吸收/发射峰分别位于454/585 nm、458/589 nm、443/576 nm和436/575 nm。二硝基取代的PXZ2N系列的光物理性质与PTZ2N相似，与PXZ分子相比，具有红移和蓝移的吸收和发射。PXZ2N-ER和PXZ2N-Lipid的最大吸收/发射峰分别位于446/531 nm和453/nm。与PTZ衍生物相比，PXZ衍生物表现出明显的红移和蓝移发射峰，导致斯托克斯位移范围减小82-139 nm。
吩恶嗪类探针标记的细胞成像
吩恶嗪分子表现出极好的生物相容性和低光毒性。通过共聚焦实验测量了非恶嗪类探针的成像性能。在与商业探针孵育和清洗后，在免清洗条件下用Phe诺沙津探针对HeLa细胞进行成像。PXZ-Mito和MitoTracker-Red(Pr=0.90)，PXZ-ER和ERTracker-Red(Pr=0.91)，PXZ-lyso和LysoTracker-Red(Pr=0.91)，PXZ-Lipid和BODIPY 493/503(Pr=0.92)，PXZ2N-ER和ERTracker-Red(Pr=0.94)，PXZ2NLipid和BODIPY 493/503(Pr=0.92)，表明细胞器具有精确的靶向能力。此外，基于PXZ/PXZ2N的探针在氙灯照射30分钟后表现出良好的光稳定性。为了进一步评估它们在连续激光激发下在活细胞中的性能，选择了PXZ-Mito和PXZ2N-Lipid，并与商业探针MitoTracker-Green和尼罗红进行了比较。PXZMito和PXZ2N-Lipid都显示出比Mitotracker-Green和Nile Red显著增强的光稳定性。基于吩恶嗪探针在活体细胞成像中的出色性能，它们被进一步应用于免洗涤条件下的多色成像。绿色通道表示PXZ2N探针，而红色通道表示PTZ探针。合并后的图像清楚地显示了内质网和溶酶体之间的空间分布差异。绿色通道显示PXZ2NLipid标记的脂滴，而红色通道显示分别标记PTZ-lyso或PTZ-Mito的溶酶体或线粒体。合并后的图像提供了对脂滴、溶酶体和线粒体的形态和定位的全面可视化。这些探头的优势在于，它们能够在相同的激光激励下发射不同波长的荧光，无需频繁切换波长即可进行多色成像。这显著提高了成像效率，并确保了细胞器信号的高度区分。
结论
通过将细胞器靶向部分引入吩噻嗪骨架，并引入共轭硝基，我们成功地开发了一系列具有大斯托克斯位移的细胞器特异性荧光探针。这些探头在免洗细胞成像方面表现出卓越的环境敏感性和卓越性能，消除了繁琐的洗涤步骤，并将样品干扰降至最低。此外，同样的分子设计策略也被扩展到基于吩恶嗪的系统中，这也显示出显著的环境响应性和在免洗条件下的良好成像能力。
参考文献
Cell wash-free fluorescent probes based on phenothiazine and phenoxazine with high photostability and large stokes shifts for targeted imaging of subcellular organelles.Zhichao Wang ,Jinxiao Lyu,Yongjie Sun,Fang Liu,Lanqing Li,Shaoping Li,Xuanjun Zhang，Mater.Today Bio 35 (2025) 102399，https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2025.102399
