内容提要
第二个近红外窗口(NIR-II, 1000 - 3000 nm)由于改善了组织穿透性，为光疗提供了一个有吸引力的平台。然而，为这一范围开发有效的光疗剂提出了重大挑战。在此，我们报道了一种基于融合环受体结构的NIR-II有机治疗剂CNTIC-4F，它具有超过1200 nm的有效吸收和高达1800 nm的荧光发射。邻芳π桥thieno[3,4b]pyrazine (TP)的掺入增强了CNTIC4F的quinoidal特性，减小了光学带隙，增强了分子间相互作用。CNTIC-4F纳米颗粒对小鼠血管的体内荧光成像在1064nm激发下显示1500 nm以上的高对比度成像。此外，CNTIC-4F纳米颗粒在1064 nm激发下的光热转换效率高达82%，可实现NIR-II成像引导下对小鼠4T1肿瘤的有效光热治疗。本研究说明了quinoidal结构在开发用于高对比度和深穿透NIR-II光疗的高级有机试剂方面的潜力。
结果与讨论
染料的分子设计和光物理性质研究
在π共轭主链中加入类醌结构是减小分子带隙的有效方法。Thieno[3,4-b]pyrazine (TP)以其亲芳功能而闻名，可以促进类醌结构的稳定，同时恢复局部芳香性。受这一特性的启发，我们将TP单元作为共轭π桥，与环五[2,1-b:3,4-b ']二噻吩(CPDT)作为电子给体(D)和2-(5,6-二氟-3oxo-2,3-二氢- 1h -茚-1-乙基)丙二腈(IC4F)作为电子受体(A)一起构建了具有A−π−D−π−A结构的融合环受体CNTIC-4F。COTIC-4F包含一个3-乙基己氧基噻吩π单元，是吸收波长最长的融合环受体之一，用于比较。
通过密度泛函理论(DFT)计算得到CNTIC-4F和COTIC-4F的优化基态几何形状及其对应的最高已占据分子轨道和最低未占据分子轨道(HOMOs/LUMOs)。这两种分子都表现出相似的HOMOs (CNTIC-4F为- 5.93 eV，而COTIC-4F为- 5.96 eV)，在它们的整个分子骨架上都有离域。然而，与COTIC-4F相比，CNTIC-4F显示出相对较低的LUMO水平(- 4.35 vs - 4.54 eV)，导致更窄的带隙(CNTIC-4F为1.39 eV vs. COTIC-4F为1.61 eV)。有趣的是，CNTIC-4F中碳-碳单键(C−C)键(或双键(C=C)键)的计算键长普遍比COTIC4F中的键长变短(或变长)，除了键号4。这种键长重分布表明CNTIC-4F的键长交替(BLA)趋势减弱，单键和双键之间的键特征更相似，表明CNTIC-4F的quinoidal特征增强。此外，CNTIC-4F中存在开壳自由基，这是由于电子从芳族结构转变为quinoidal结构造成的，其在电子顺磁共振(EPR)光谱中的突出信号证实了这一点。这些观察结果共同表明，与COTIC相比，加入亲芳TP单元促进了从芳电子结构到奎线电子结构的部分转换，这进一步导致了CNTIC-4F的电子结构离域、LUMO能级的下降和带隙的缩小。
用紫外-可见-近红外光谱和光致发光光谱分析了这两种溶解在甲苯中的分子的光学性质。CNTIC-4F的吸光度范围从700 nm扩展到1000 nm，在930 nm处观察到峰值吸收。由吸收边确定的光能带隙(Eg)为1.21 eV。COTIC-4F在833 nm处有一个吸收峰，Eg为1.36 eV。在其他有机溶剂中也可以观察到这种从COTIC-4F到CNTIC-4F的吸光度红移。CNTIC-4F和COTIC-4F的PL光谱显示，它们的最大发射峰分别在1017 nm和921 nm处。这些吸光度和发射结果与时间相关(TD)DFT计算结果一致。TDDFT结果也证实了这些光学跃迁沿π共轭分子主链表现出明显的π−π*激发特征。
纳米粒子的制备与性质研究
为了确保在水溶液中的溶解性，我们使用两亲性聚合物DSPE-mPEG2000包封疏水分子，形成水溶性纳米颗粒(NPs)。加载效率约为84%透射电镜(TEM)检查显示CNTIC-4F NPs具有球形形貌。动态光散射(DLS)测量显示平均尺寸为71 nm。CNTIC-4F NPs的表面ζ电位估计为−34.8 mV。NPs在PBS中表现出良好的稳定性，没有明显的聚集，从1周内一致的吸收、PL发射光谱和平均尺寸可以看出。
值得注意的是，CNTIC-4F NPs表现出广泛的NIR-II吸收，延伸到1400 nm，峰值位于1116 nm。最大峰的摩尔消光系数(ε)为7.53 × 104 M−1 cm−1，高于已有报道的1064 nm激发分子光热剂。CNTIC-4F从甲苯中的单分子状态到NPs内的包封状态红移了136 nm，表明形成了J聚集的NPs相比之下，COTIC-4F NPs的吸光度分布主要位于NIR-I区，峰值位于826 nm处。此外，CNTIC-4F NPs的吸收在连续暴露于激光后几乎保持不变。相比之下，商业染料吲哚菁绿(ICG)的吸收在10分钟内明显下降，这表明CNTIC-4F NPs具有抗光漂白特性。光致发光光谱显示，CNTIC-4F NPs和COTIC-4F NPs都是NIR-II发射。CNTIC-4F NPs在1252和1343 nm处表现出双发射峰，尾发射延伸到1800 nm以上。COTIC-4F NPs的发射峰位于1091 nm处。估计CNTIC-4F NPs和COTIC-4F NPs的量子产率分别为0.056%和0.051%。CNTIC-4F NPs的荧光强度随着溶液浓度从0.015到1 mM的增加而增加。特别是在NIR-II发射窗口1500 nm以上，在相同浓度为0.01 mM时，CNTIC-4F NPs的亮度高于COTIC-4F NPs。
综上所述，理论和实验研究证实，CNTIC-4F纳米粒子在水环境中具有明显的吸收到1200 nm以上，发射到1800 nm以上的特性，主要是由于分子内的推拉效应、quinoidal谐振结构的稳定以及Jaggregation的形成。这些有效和稳定的NIR-II吸收和发射特性表明了高对比度和深层组织NIR-II光生物应用的巨大潜力。
为了研究发射波长对渗透深度的影响，我们模拟了在1%脂质溶液中浸泡不同深度的充满荧光探针的毛细管立方体。在808和1064 nm激光激发下，分别采集了1300 nm以上的发射图像。首先，我们比较了CNTIC-4F NPs和ICG在808 nm激发下的成像性能。与ICG相比，CNTIC-4F NPs具有更明亮和更高分辨率的毛细轮廓。ICG的荧光信号在深度超过4mm后显著减弱，而CNTIC-4F NPs在深度为6mm时仍保持荧光信号。此外，在1064 nm和808 nm激光分别激发下，CNTIC-4F NPs在1064 nm激发下的成像性能明显优于CNTIC-4F NPs，亮度和分辨率更高。
纳米粒子的活体荧光成像
通过静脉注射CNTIC-4F NPs(剂量为200 μL，浓度为1 mg mL−1)，小鼠全身血管成像清晰可见。利用NIR-II的强吸收特性，我们使用1064 nm激光，面内激发功率密度为80 mW cm - 2进行照射，最大限度地减少了组织散射和自身荧光的影响采用不同的长通(LP)滤光片采集1200 nm和1500 nm以上的荧光信号。如图3所示，静脉注射30min后，小鼠腹部和后肢血管结构清晰可见。特别是使用1500 nm滤镜，腹部和后肢血管系统的细毛细血管变得更清晰，更容易区分。这种方法可以使小鼠腹部和后肢区域的小血管可视化。腹部毛细血管直径为63 μm，后肢毛细血管直径为121 μm。这些血管分别以5.9和5.7的高信本比(SBR)与周围组织清晰区分。相比之下，当使用1200 nm LP滤波器时，腹部和后肢血管的相同血管的SBR比率分别为3.2和5.9。这些结果证明了CNTIC-4F NPs作为NIR-II激发和NIR-IIb发射探针的有效性。
纳米粒子的光热治疗研究
采用1064 nm激光以不同功率照射不同浓度CNTIC-4F NPs溶液500 s，并用红外热像仪记录温度变化，测量了CNTIC-4F NPs的光热转换效率。根据美国国家标准协会(ANSI)制定的安全标准，与980或808 nm激光器相比，选择1064 nm激光器提供了更高的最大允许曝光(MPE)的优势。此外，CNTIC-4F NPs在1064 nm处的吸光度高于980和808 nm，有利于更强的光热转换。采用1064 nm激发光热聚合物PBD,44进行比较。浓度为0.05 mg mL−1的CNTIC-4F NPs在0.5 W cm−2功率的1064 nm激光激发下，温度从25.6°C快速升高到50.6℃，表明在低功率下光热转换有效。相比之下，相同浓度的PBD NPs温度从27.7℃升高到47.2℃。CNTIC-4F NPs的温度随着辐照时间、浓度和激光功率的增加而升高。例如，当浓度从0.01 mg mL−1增加到0.1 mg mL−1时，平台温度从32.6°C增加到64.2℃。冷却曲线的定量分析显示CNTIC-4F NPs的PCE为82%，而PBD的PCE为64%。这是1064nm激发光热剂中pce最高的一种。此外，在连续5个加热和冷却周期后，升温曲线保持稳定，突出了CNTIC-4F NPs在NIR-II光疗中的优越光热性能。
基于NIR-II荧光成像和体外光热特性，我们评估了CNTIC-4F NPs的体内NIR-II光疗效果。cRGD(环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)被用作靶向配体，以增强CNTIC-4F NPs对肿瘤的特异性通过用RGD修饰NPs，提高了4T1细胞的选择性摄取，从而实现了肿瘤的有效靶向和成像给4T1肿瘤小鼠静脉注射cRGD CNTIC-4F NPs (200 μL, 1 mg mL - 1)后，1064 nm激光激发的肿瘤区域荧光强度增加，在给药后24 h达到峰值，然后由于肝脏代谢和NPs的清除而逐渐下降。红外热图像显示，在1064 nm激光的激发下，肿瘤部位在5分钟内温度从35℃上升到50℃，这与CNTIC-4F NPs的高PCE一致。相比之下，只注射PBS的对照组小鼠，体温从36℃略微升高到38℃。在接受cRGD CNTIC-4F NPs的小鼠中，使用1064 nm激光进行10分钟的体内光热治疗导致肿瘤生长在14天内受到抑制，而使用PBS加光治疗的对照组以及仅使用NPs的对照组显示出相似的肿瘤生长速率。在整个实验过程中，小鼠表现出稳定的体重增长，没有记录死亡率，表明光热疗法耐受性良好，无不良反应。这些发现证明了cRGD CNTIC-4F NPs作为靶向NIR-II光治疗剂的有效性和安全性，通过靶向治疗和实时成像反馈为增强癌症治疗提供了潜力。
总结
综上所述，我们通过引入TP π桥构建了具有更长的波长响应的融合环受体分子CNTIC-4F。与对照分子COTIC-4F相比，这种掺入增强了CNTIC-4F的quinoidal特性，导致电子结构更加离域，光学带隙更小，分子间相互作用增强。封装的CNTIC4F NPs在1200 nm以上表现出NIR-II吸收，荧光发射延伸到1800 nm，在1500 nm以上提供高对比度的NIR-II荧光成像。此外，CNTIC-4F NPs具有抗光漂白性能和高达82%的1064 nm激发PCE。体内治疗实验表明，在低功率照射下，4T1肿瘤的快速产热和有效消融。优越的成像能力和多功能治疗能力的结合使CNTIC-4F NPs有望用于NIR-II光疗。这项工作也为设计具有增强NIR-II区域光响应的融合环受体提供了有价值的见解。CNTIC-4F NPs所证明的光热效应的功效可能超出光热治疗，并显示出光热神经调节的潜力。
参考文献
Quinoidal π-Bridges for a Fused-Ring Acceptor with Enhanced Near-Infrared-II Photothermal Therapy and Fluorescent Emission beyond 1500 nm， Wuke Cao, Xun Zhang, Xueqin Yang, Haitao Sun,* Zhongxin Chen,* and Yongye Liang*,ACS Materials Lett. 2024, 6, 2687−2695,https://doi.org/10.1021/acsmaterialslett.4c00759
