内容提要
将分子成像扩展到短波红外(SWIR, 900 ~ 1400 nm)区域，可以通过低组织自身荧光和散射，提供生物系统中生物分子的深层组织可视化。从美国食品和药物管理局批准的近红外(NIR)探针和临床试验来看，只有吲哚菁绿(ICG)及其类似物被批准用于生物医学应用。激发波长小于800 nm限制了这些探针从深层组织渗透和非侵入性荧光成像。在此，我们合成了基于ICG的π-共轭扩展菁菁染料ICG-C9和ICG-C11作为生物相容性染料，以及在水中发射波长分别为922和1010 nm的水溶性swr发射探针。此外，还合成了基于ICG、ICG-C9和ICG-C11的荧光标记剂，用于开发SWIR分子成像探针。利用ICG、ICG-C9和ICG-C11的荧光，我们通过观察活体小鼠的表面受体(EGFR和HER2)和肿瘤血管，展示了乳腺肿瘤的三色SWIR荧光成像。此外，我们展示了使用ICG偶联抗癌药物Kadcyla和ICG-C9或ICG-c11偶联的膜联蛋白v对乳腺肿瘤凋亡的双色SWIR荧光成像。最后，我们展示了Kadcyla诱导的乳腺肿瘤收缩的长期(38天)SWIR荧光成像。本研究为生物相容性和水溶性荧光发射菁氨酸探针的多路荧光分子成像提供了一种通用策略。
实验结果与讨论
ICG、ICG-C9和ICG- C11的合成及其光学性质和细胞毒性
我们合成了两种π共轭扩展菁菁染料ICG- c9和ICG- c11作为ICG类似物，用于多路SWIR荧光成像。ICG- c9和ICG- c11的π共轭长度分别比ICG长一个和两个双键。由于菁菁染料的荧光最大值随着多甲基链中一个双键的增加而增加约100 nm，因此ICG- c9和ICG- c11所发射的波长分别比ICG长约100或200 nm。这是第一个成功扩展ICG聚甲基链π共轭的研究。为了合成一个π-共轭扩展的ICG类似物ICG在二甲基亚砜(DMSO)中的荧光最大值为830 nm，而ICG- c9和ICG- c11在DMSO中的荧光最大值分别为955和1078 nm。与在DMSO中的荧光光谱相比，ICG、ICG- c9和ICG- c11在水中的荧光光谱出现了25 ~ 68 nm的蓝移。在水相中，ICG、ICG- c9和ICG- c11的吸收光谱显示肩峰的吸光度增加(ICG、ICG- c9和ICG- c11在DMSO中的吸光度分别为730、805和902 nm)。这一发现表明，聚集的菁染料种类的数量按照ICG < ICG- c9 < ICG- c11的顺序增加，导致菁染料的荧光亮度因自猝灭而降低。
虽然ICG、ICG- c9和ICG- c11在纯水中的荧光发射很弱，但在BSA的存在下，其荧光发射明显增强。因此，我们使用含有BSA的ICG、ICGC9和ICG- c11水溶液进行SWIR荧光成像。采用三种带程滤光片(900±25、1000±25和1100±25 nm)检测ICG、ICG- c9和ICG- c11在水相(1% BSA)中的荧光亮度，激发波长分别为785、905和975 nm。当ICG、ICG- c9和ICG- c11的水溶液(1% BSA)在785 nm处激发时，仅ICG在900 nm处观察到SWIR荧光发射。在905 nm激发后，ICG-C9和ICG-C11均在1000 nm处观察到SWIR荧光发射。相比之下，当溶液在975 nm处激发时，ICG-C11在1100 nm处发出SWIR荧光。这些结果表明，ICG (Ex: 785 nm/Em: 900 nm)和ICG- c9 (Ex: 905 nm/Em: 1000 nm)或ICG (Ex: 785 nm/Em: 900 nm)和ICG- c11 (Ex: 975 nm/Em: 1100 nm)的组合可以实现多路SWIR荧光成像。ICG、ICG- c9和ICGC11在DMSO中的荧光量子产率分别为13%、4.3%和2.1%。而在水中(1% BSA)， ICG、ICG- c9和ICG- c11的BSA分别为3.4、1.2和0.12%。
我们检测了ICG、ICG- c9和ICG- c11在水(1% BSA)中的水稳定性。虽然花青素染料ICG、ICG- c9和ICG- c11在水溶液中不稳定，但由于与BSA的络合作用，BSA的存在显著提高了它们的化学稳定性6ICG、ICG- c9和ICG- c11在水(1% BSA)和DMSO中的温度和浓度依赖关系如图S7和S8所示。ICG、ICG- c9、ICG- c11在溶液中的水动力直径如图所示。我们还检测了ICG、ICG- c9和ICG- c11在785、905和975 nm激光(20 mW/cm2)照射下的光稳定性。我们观察到激光照射60 min导致ICG(30%)、ICG- c9(25%)和ICG- C11(20%)的光漂白。通过测定三种菁染料的时间分辨荧光衰减曲线，考察其荧光寿命。ICG、ICG- c9和ICG- c11在PBS (1% BSA)中的荧光衰减曲线均可拟合为单指数曲线，测定ICG、ICG- c9和ICG- c11的荧光寿命分别为0.80、2.7和7.1 ns。使用MTT法(实验部分)评估ICG、ICG- c9和ICG- c11在HeLa细胞中的细胞毒性。ICG- c9和ICG- c11的细胞毒性与ICG相似，且呈剂量依赖性。当染料浓度小于10 μM时，所有菁氨酸与HeLa细胞孵育6 ~ 48 h，均未表现出明显的细胞毒性。
SWIR荧光标记剂和SWIR染料抗体偶联物的合成
作为SWIR荧光标记剂，我们合成了ICG、ICGC9和ICG- c11的n -羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、马来酰亚胺和炔衍生物。ICG、ICG- c9、ICG- c11抗体偶联物的制备方法见图。我们使用NHS、马来酰亚胺和ICG、ICG- c9和ICG- c11的炔衍生物对抗体分子进行SWIR荧光标记。NHS衍生物用于标记整个抗体分子中的氨基。用马来酰亚胺衍生物来标记还原抗体分子中的巯基。最后，基于点击化学，使用炔衍生物标记抗体分子，在抗体分子中引入叠氮化物基团。SWIR染料抗体(赫赛汀)偶联物的吸收光谱和荧光光谱如图所示。ICG-Ab、ICG-C9-Ab和ICG-C11-Ab (Ab: Herceptin)分别在820、921和1039 nm处达到荧光最大值。根据SWIR染料的消光系数，计算出ICG-Ab、ICG-C9-Ab和ICG-C11-Ab的抗体/SWIR染料的标记比分别为0.5、0.8和1.1。ICG、ICG- c9和ICG- c116在水中最大吸收时的摩尔消光系数分别为14.7 × 104、9.55 × 104和5.48 × 104 M−1 cm−1。与ICG-Ab和ICG-C9-Ab相比，ICG-C11- ab的高标记率可能是由于ICG-C11的高疏水性，导致SWIR染料对抗体分子的可及性增加。我们在之前的文章中报道，通过改变SWIR染料/抗体。
体外和体内乳腺肿瘤的SWIR荧光分子成像
使用由NHS、马来酰亚胺和炔衍生物制备的SWIR染料抗体(Erbitux)偶联物，我们在体外和体内对乳腺肿瘤进行了SWIR荧光成像。用SWIR染料- erbitux偶联物首次成像egfr阳性人乳腺癌细胞(MDA-MB-468)，检测SWIR染料-抗体偶联物的探针活性。与用SWIR染料(ICG、ICG- c9和ICG- c11)孵育的对照细胞相比，用ICG- nhserbitux、ICG- c9 - nhs - erbitux和ICG- c11 - nhs - erbitux偶联物孵育的细胞表现出较强的SWIR荧光发射。该结果表明SWIR染料- erbitux偶联物与MDA-MB-468细胞表面的EGFR受体结合。接下来，我们对活体小鼠乳腺肿瘤进行了SWIR荧光成像。将egfr阳性的人乳腺癌细胞(MDA-MB-468)移植至裸鼠体内制备乳腺荷瘤小鼠。将ICG-NHS-Erbitux、ICG-C9-NHS-Erbitux和ICG-C11-NHS-Erbitux静脉注射到小鼠体内，在所有注射了ICG-NHS-Erbitux、ICG-C9NHS-Erbitux或ICG-C11-NHS-Erbitux的小鼠乳腺肿瘤中检测到肿瘤的SWIR荧光发射(>1000 nm)(第4天左图)。在SWIR荧光成像中，ICG、ICG- c9和ICG- c11分别在785、905和975 nm处被激发。较长波长的激发(ICG-C9为905 nm, ICG-C11为975 nm)由于组织自身荧光较低，提供了较低背景信号的优势。乳腺肿瘤的离体图像清楚地显示，SWIR染料- erbitux偶联物在乳腺肿瘤中明显积聚(右侧图像)。此外，我们使用由ICG、ICG- c9和ICG- c11的马来酰亚胺和炔衍生物制备的SWIR染料- erbitux偶联物对乳腺肿瘤小鼠进行了SWIR荧光成像。与注射SWIR染料- nhs -Erbitux偶联物的小鼠一样，在注射SWIR染料-(马来酰亚胺或炔)偶联Erbitux的小鼠中，可以观察到乳腺肿瘤明显的SWIR荧光发射。这些结果也支持SWIR染料(马来酰亚胺或炔)偶联Erbitux在egfr阳性乳腺肿瘤中的积累(MDAMB-468)。
乳腺肿瘤的多色SWIR荧光分子成像
为了实现多路SWIR荧光成像，我们首先使用不同的光学滤光片，在785、905和975 nm激发下，检测ICG、ICG- c9和ICG- c11(在含有1% BSA的PBS中)的荧光ACS Applied Materials & Interfaces www.acsami.org研究文章亮度。当用785 nm激光照射三种花青素染料时，几乎完全从ICG观察到SWIR荧光发射。相比之下，当用905 nm和975 nm激光照射SWIR染料时，ICG- c9和ICG- c11都观察到SWIR荧光发射(>1000 nm)，而ICG则没有。而在975 nm激发下，ICG-C11的SWIR荧光强度约为ICG-C9的4倍。这些发现表明，通过选择ICG (Ex: 785 nm)和ICG- c9 (Ex: 905 nm)的组合，或ICG (Ex: 785 nm)和ICGC11 (Ex: 905或975 nm)的组合，可以进行双色SWIR荧光成像。ICG、ICG- c9和ICG- c11在785、905和975 nm激发后的荧光强度如图所示。
为了对两种表皮生长因子受体EGFR和HER2进行SWIR荧光分子成像，我们制备了两种乳腺癌荷瘤小鼠(KPL-4和MDA-MB468)。Western blot分析显示，KPL-4细胞过表达EGFR和HER2，而MDA-MB468细胞过表达EGFR，但不过表达HER2。在两个乳腺肿瘤中观察到ICG-Erbitux的SWIR荧光发射。相比之下，ICG-C11-(NHS)- herceptin仅在kpl4移植(her2阳性)肿瘤中观察到SWIR荧光发射，而在MDA-MB-468细胞移植(her2阴性)肿瘤中没有观察到。这些观察结果与Western blot分析结果一致。接下来，我们对荷瘤小鼠的两种受体(KPL-4和MDA-MB-468)进行了SWIR荧光成像。这里，KPL-4细胞过表达HER2和PD-L1(程序性死亡配体1)，而MDA-MB-468细胞过表达EGFR和PD-L1。PD-L1是一种免疫检查点分子，在几种癌症中过度表达在KPL-4细胞移植的小鼠中，使用ICG-PD-L1(红色，Em: 1000 nm)和ICG-C11Herceptin(绿色，Em > 1050 nm)的双色SWIR荧光发射清晰地成像乳腺肿瘤。对于移植了MDA-MB-468细胞(pd - l1阳性和egfr阳性)的肿瘤小鼠，双色SWIR成像也成功。采用ICGPD-L1(红色，Em: 1000 nm)和ICG-C11-Erbitux(绿色，Em: 1100 nm)进行成像。PD-L1与表皮生长因子受体(HER2或EGFR)双色SWIR荧光分子成像时间过程如图。
此外，我们进行了三色SWIR荧光成像，以显示kpl -4移植小鼠的两种表面受体(HER2和EGFR)和肿瘤血管。使用三种SWIR荧光探针(ICG-Herceptin, ICG-C11-Erbitux, ICG-C9)进行成像。注射ICGHerceptin 1天后进行HER2的SWIR荧光成像。在KPL-4细胞移植的肿瘤中观察到强烈的SWIR荧光发射(Em: 900 nm, Ex: 785 nm)(第2天的红色图像)。注射ICG-C11Erbitux后，在肿瘤中也观察到ICGC11-Erbitux的SWIR荧光发射(Ex: 905 nm, Em > 1050 nm)(第3天和第4天的绿色图像)。红色和绿色通道的合并图像清楚地显示了HER2和EGFR在KPL4细胞移植的乳腺肿瘤中的共定位。最后，我们将ICG-C9 (0.1 mM，含1% BSA的PBS)注射到肿瘤小鼠体内，进行肿瘤新生血管成像(第4天的青色图像)。用905 nm激光激发ICG-C9，用1000 nm带路滤光片检测其荧光发射。虽然用905 nm光照射ICG-C9和ICG-C11-Erbitux，但在ICG-C9中主要观察到SWIR荧光。这是因为ICG-C9 (200 μL 0.1 mM PBS溶液)的注射量远大于ICG-C11-Erbitux (100 μL 1 μM PBS溶液)的注射量。HER2和血管合并图像显示，kpl -4移植小鼠的肿瘤血管在乳腺肿瘤周围发育。
结论
尽管在合成SWIR发光有机染料方面取得了重大进展，但适合用于生物医学研究的生物相容性和水溶性SWIR荧光探针的报道很少。ICG是fda批准的唯一一种发出swr的花青素染料，目前用于医疗应用，如术中血管造影、神经外科、冠状动脉手术和肝脏手术。到目前为止，已经有几个小组证明了ICG作为一种荧光染料的使用。虽然ICG可以作为SWIR荧光探针进行体内成像，但其激发波长限制在800 nm以下，导致单色SWIR荧光成像。因此，我们开发了π共轭扩展菁染料ICG-C9和ICG-C11。
我们的SWIR成像技术的重要特点是使用生物相容性和水溶性的花青素染料，ICG-9和ICG-C11在SWIR区域发射。ICG-9和ICGC11可以在大约900和1000 nm处激发，实现多色SWIR荧光成像。利用ICG、ICG- c9和ICG- c11的抗体偶联物，我们在her2阳性和egfr阳性荷瘤小鼠中展示了表面受体和肿瘤血管的多路SWIR荧光成像。此外，我们还展示了一种抗癌药物Kadcyla诱导的乳腺肿瘤缩小的长期(38天)SWIR荧光成像。我们假设所提出的发射SWIR荧光的菁氨酸探针将加速SWIR荧光成像的临床转化。
参考文献
Biocompatible and Water-Soluble Shortwave-Infrared (SWIR)Emitting Cyanine-Based Fluorescent Probes for In Vivo Multiplexed Molecular Imaging， Mahadeva M. M. Swamy,* Yuta Murai, Kenji Monde,* Setsuko Tsuboi, Aravind K. Swamy, and Takashi Jin*. ACS Appl. Mater. Interfaces 2024, 16, 17253−17266 https://doi.org/10.1021/acsami.4c01000
