大家好，今天为大家介绍一篇来自复旦大学化学系SMILe课题组 （https://www.funmi2.org/）发表在Nano Letters上的文章-自发闪烁的方酸菁荧光探针用于活细胞超分辨成像，“ Squaraine Dyes Exhibit Spontaneous Fluorescence Blinking That Enables Live-Cell Nanoscopy”。 超分辨成像技术突破了传统的光学衍射极限。基于单分子定位显微成像是超分辨成像技术中的一类。利用单个分子的随机光闪烁特性，通过提取每个图像中单分子的位置信息，将数千幅图像重构成一幅超分辨图像，从而成为研究细胞超微结构的有力工具。基于单分子定位超分辨成像需要能够闪烁的荧光分子，从而实现在特定激光激发下荧光分子只有小部分处于荧光态。通常要实现这一过程，需要利用高功率的紫外光进行活化，或者添加大量的生物亲核试剂硫醇，同时结合高功率激光照射。
图1、此论文的设计思路。
作者对加入亲核试剂及酸前后化合物紫外吸收变化进行了表征，发现了方酸菁染料与亲核试剂进攻的可逆性并伴随着荧光的关闭与打开，同时发现了探针的pH响应。通过理论计算发现了方酸菁染料的反应位点。质谱和核磁对方酸菁及加成产物的结构进行表征证明了加成化合物的存在。
图2、方酸菁探针同氢氧根的可逆反应。
在之前实验的基础上，作者通过分子的设计对方酸菁化合物的光物理性质及与亲核试剂的反应进行了调控。通过引入不同的取代基成功的改变了方酸菁分子的吸收发射区域和与亲核试剂反应的反应平衡常数。
图3、方酸菁探针吸收光谱以及对pH值的响应。
表1、方酸菁分子的光物理性质。
探针对谷胱甘肽的响应与氢氧根响应现象相同。接下来作者对方酸菁染料进行了单分子下发光行为的探究。在中性的缓冲溶液中，在638的激光激发下，荧光团只有一小部分荧光团激发并发射光子。在连续激发的不同时间点观察到不同的探针子集。方酸菁探针在中性缓冲溶液中有自发闪烁的荧光行为。随着功率变大或谷胱甘肽加入均会使处于荧光态的分子减少。在100-400W/cm2功率激发下探针的定位精度都在10 nm以下。在加入谷胱甘肽前后探针的占空比均在千分之2左右，加入谷胱甘肽后亮态时间变短，闪烁次数会增加。
图4、方酸菁的荧光单分子性质表征。
作者从荧光团的随机光切换信号中重建SMLM图像，观察到了更清晰的细胞膜结构分辨率可达112纳米，并观察到了活的Hela细胞中不同形态的伪足结构。显示了成功分辨了两根距离为232纳米的伪足，这用传统的荧光显微镜受到光衍射极限的影响而无法分辨。
图5、 方酸菁染料用于细胞膜的超分辨成像。
结论
作者首次报道了基于方酸菁染料的自发闪烁行为。在中性缓冲溶液中638 nm激光激发下，方酸菁分子具有自发闪烁行为，且具有合适的分子占空比，亮度高于同波段的花菁染料和罗丹明染料。此外，团队成功地将这种自发闪烁探针用于活细胞的超分辨成像，可以利用自发闪烁的荧光团探索更多生物过程。
参考文献
Squaraine Dyes Exhibit Spontaneous Fluorescence Blinking That Enables Live-Cell Nanoscopy, Bingjie Zhao, Daoming Guan, Jinyang Liu, Xuebo Zhang, Shuzhang Xiao, Yunxiang Zhang, Bradley D. Smith, and Qian Liu,* NanoLett. 2024,https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.4c00595
