内容提要
基于单组分治疗剂的多模态光治疗平台的构建具有吸引力，但是充满挑战。聚集诱导发光材料(AIEgens)的出现，特别是在第二近红外窗口(NIR-II)发射荧光的发光材料，凭借其可调节的辐射/非辐射能量消耗途径、更深的穿透深度和聚集性增强的治疗效果，为癌症治疗提供了强有力的工具。虽然体积较大的噻吩π桥通常用于构建NIR-II AIEgens，如正烷基噻吩、3,4-乙氧基二氧噻吩和苯并[c]噻吩，但它们在治疗行为上的细微差异尚未得到全面的研究。本文通过系统的研究发现，含AIEgen BTNS的苯并[c]噻吩具有良好的NIR-II荧光发射强度、高效的活性氧生成和较高的光热转换效率。最后，通过使用BT-NS纳米颗粒，证明了NIR-II荧光/光声/光热成像引导下协同光动力/光热消除肿瘤的前所未有的性能。
实验结果与讨论
AIEgens的分子设计与量化计算
硒二唑[2,3-c]被推荐作为电子受体片段，考虑到硒的重原子效应通过促进系统间交叉(ISC)过程有利于扩增ROS的产生。与含硫的萘[2,3-c][1,2,5]噻二唑相比，其更强的吸电子能力使其更容易在NIR-II区发射。叔丁基二苯胺的扭曲分子结构作为分子转子，保证了AIE属性，同时作为电子给体促进了ICT。合理设计连接电子给体和电子受体单元的π桥，可以共价连接具有不同光物理性质的荧光团。我们首先选择苯基作为π桥得到P-NS。为了延长吸收/发射波长，采用含噻吩、正烷基噻吩、3,4 -乙烯二氧噻吩、苯并[c]噻吩的各种噻吩基π桥合成了T-NS、C6T-NS、OT-NS和BT-NS。为了深入了解它们的结构细节，利用Gaussian 09程序在B3LYP/6-31G (d,p)水平上对P-NS、T-NS、C6T-NS、OT-NS和BT-NS在基态(S0)下的优化几何形状进行了密度函数理论(DFT)模拟。当苯环被噻吩取代后，由于噻吩的位阻较小，π桥与电子受体之间的二面角从54.6°减小到38.6°/ 49.2°。为了扭转结构构象，在噻吩部分安装了不同的取代基。大的基团的存在使得二面角范围从51.4°到75.7°更大，表明扭曲的结构主干有利于减轻分子间π -π相互作用。荧光团的最低未占据分子轨道(LUMOs)主要位于中心电子受体核心，而最高已占据分子轨道(HOMOs)主要分布在整个分子上。BT-NS显示出最窄的能带隙为1.74 eV，表明吸收波长延长，这是由于苯并[c]噻吩单元的共轭长度增加所致。
AIEgens的光物理性质，光热和光动力学性质研究
为了了解其光物理特性，采用紫外-可见-近红外光谱和光致发光光谱进行了研究。在577、661、589、601和662 nm处测得THF中所得产物的最大吸收波长，在660 nm处的摩尔系数值(η)分别为0.18×104、1.0×104、0.5×104、0.56×104和0.76×104 M-1cm-1 。与计算的带隙一致，T-NS和BT-NS具有相对较长的吸收谱线，其吸收峰以660 nm为中心，这有利于利用660 nm激光器。这些化合物的标准化PL光谱显示出非常宽的发射光谱，最大发射波长分别为789、990、896、941和1003 nm。值得注意的是，BT-NS具有超过1000 nm的最长发射波长，Stokes位移高达343 nm，显示出典型的NIR-II发射。为了确定其AIE特性，我们测试了五种染料在不良溶剂水(fw)含量为0 ~ 90%的THF/水混合物中的荧光光谱。所有化合物作为单体在THF溶液中都有微弱的发光。然而，随着fw逐渐增大形成聚集体，分子的自由运动受到限制，发射强度增强，表现为典型的AIE性质。以DCFH-DA为指标进一步检测AIEgens的ROS生成能力。在极低浓度(1 μM)下，用功率密度为0.3 Wcm2的660 nm激光照射525 nm处，记录了这些AIEgens的荧光变化。BTNS在光照10 min后ROS生成增加约150倍，远高于其他化合物和商用光敏剂Ce6。BT-NS较小的能隙允许能量通过ISC传递，并具有优异的ROS生成效率。探讨了AIEgens在DMSO溶液中的光热转化能力。激光持续照射5min后，BTNS的温度在60℃左右达到最大值，高达34℃，显示出出色的产热效率。在功率密度为0.3 Wcm2的照明下，它在固体粉末中可以达到高达156℃的温度。
BT纳米粒子的AIE，光热和光动力学性质研究
BT-NS具有优异的光热生成效率、ROS生成能力和NIR-II成像能力，具有优异的光疗性能。为了使BT-NS具有良好的水分散性，我们采用DSPE-mPEG2000作为基质对BT-NS进行封装形成均匀的NPs。动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)检查发现，制备的NPs具有均匀的球形形貌，直径约为67 nm，这是由于增强的渗透性和滞留性(EPR)效应而在肿瘤中积累的最佳选择。BT-NS NPs在室温下保存7天后，在大小和吸水率方面均表现出优异的胶体稳定性。与THF溶液相比，BT-NS NPs的UV-Vis-NIR吸收光谱和PL光谱呈现红移趋势，峰值分别位于693 nm和1020 nm。BT-NS NPs具有 0.15%的相对QY突出了NIR-II FLI的巨大潜力。在660 nm激光照射10分钟后，BT-NS NPs的ROS生成能力增强了122倍，这表明BT-NS NPs在PDT中的潜在应用。BT-NS NPs的最高温度与样品浓度和激光功率密度呈正相关，表明可以精确调节光热产生以达到最佳治疗效果。根据冷却曲线计算，BT-NS NPs的PCE约为41.8%。这些实验结果证明了BT-NS NPs在辐射和非辐射衰变之间的精细平衡，可以用作肿瘤多模式光诊疗。
BT纳米粒子细胞层次研究
CCK-8法定量评价BT-NS NPs对4T1肿瘤细胞的细胞毒性和生物相容性。在50 μg∙mL - 1的浓度下，BTNS NPs处理的正常3T3细胞和4T1细胞的存活率均保持在90%以上，暗毒性最小，具有良好的生物相容性。在660 nm激光照射下，BT-NS NPs对4T1、A549和B16细胞的杀伤作用随着浓度从0到50μg∙mL - 1的增加而明显增强，表现出明显的光毒性。为了更好地研究细胞内化，制备了FITC标记的BT-NS NPs。将FITC标记的BTNS NPs与4T1细胞孵育24小时后，用Lyso-Tracker Red对其进行染色，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)显示FITC标记的BT-NS NPs(绿色荧光)和溶酶体探针(红色荧光)之间的图像重叠良好，表明BT-NS NPs有效内化到4T1细胞中并在溶酶体中积累。随后，在细胞水平上评估BT-NS NPs的ROS生成效率。在BTNS NPs和660 nm激光处理组，细胞中观察到明显的DCFH绿色荧光。为了直观验证BT-NS NPs的细胞毒性，活细胞/死细胞共染色，活细胞用FDA(绿色荧光)染色，死细胞用PI(红色荧光)染色。BT-NS NPs加激光组监测到亮红色荧光，表明具有可行的杀瘤能力。
BT纳米粒子动物层次研究
鉴于BT-NS NPs在细胞水平上具有良好的抗肿瘤效果，我们进一步评估其体内成像和治疗效果。荷瘤小鼠尾静脉注射BT-NS NPs, 6 h后肿瘤部位出现微弱的荧光信号，显示BT-NS NPs在肿瘤区域内缓慢积累，注射后24 h浓度达到峰值。随后，由于代谢过程，信号逐渐减弱。PAI是一种收集光热介质照射后产生的声波的成像技术，它具有侵入性小、穿透深度深的优点。正如预期的那样，肿瘤部位在指定时间的光声信号强度与荧光信号保持良好的一致性。需要指出的是，PA信号主要分布在肿瘤浅表组织内，这可能与实体瘤浅表区血管丰富有关。为了提高BTNS NPs的穿透能力，有希望的策略包括采用物理干预来改变间质流体压力，以及实施化学修饰来提高靶向效果。注射后96 h主要器官的离体NIR-II FLI为BT-NS NPs良好的肿瘤保留效果提供了坚实的事实。此外，肝脏和脾脏中可见明显的荧光信号，表明BT-NS NPs的代谢途径主要通过肝胆系统。注射后24 h, BT-NS NPs保留率达到峰值，用660 nm激光照射肿瘤。肿瘤温度在10分钟内迅速升高至约50.7℃，足以对肿瘤进行PTT治疗。这些成像结果表明，BT-NS NPs具有良好的肿瘤保留行为和显著的多模态成像性能。我们继续在4T1肿瘤移植BALB/c小鼠模型中评估BT-NS NPs的肿瘤杀伤活性。将4T1荷瘤小鼠随机分为PBS组、PBS+ L组、BT-NS NPs组和BT-NS NPs+L组。如图所示，对照组(PBS、PBS+L和BT-NS NPs)的肿瘤体积在研究期间迅速增加。在第10天，小鼠的肿瘤体积从最初的大小扩大了大约8倍，这表明无论是激光治疗还是单独使用BT-NS NPs都不能有效消除肿瘤。相反，在第4天发现BT-NS NPs+L组肿瘤几乎被根除，10天内没有观察到复发迹象。得益于PDT和PTT的联合治疗效果，单次注射和激光照射取得了显著的肿瘤杀伤效果。为了进一步阐明BT-NS NPs的体内肿瘤杀伤机制，我们进行了组织学和免疫组织化学研究。肿瘤切片的H&E染色直观地显示PDT和PTT联合使用对肿瘤组织损伤严重，肿瘤细胞异常明显。与富含大量正常肿瘤细胞的对照组相比，BT-NS NPs+L组肿瘤细胞出现大量空腔和明显的核凋亡。TUNEL免疫荧光染色进一步证实BT-NS NPs+L治疗组肿瘤细胞严重凋亡。同时，内皮细胞标志物CD31被用来评估微血管密度。结果显示，经过BT-NS NPs和激光治疗后，cd31阳性血管密度显著降低，进一步证实了诱导血管破裂的治疗效果。此外，采用Ki67染色法检测肿瘤细胞的增殖能力。与其他组相比，BT-NS NPs+ L治疗组的肿瘤细胞表现出明显的增殖能力丧失。
结论
本文通过精细的π桥分子调制制备了用于肿瘤多模态光疗的NIR-II AIEgens。苯并[c]噻吩具有较长的共轭长度和拥挤的空间势垒，被证明是构建NIR-II偶氮基的5种常用π桥的最佳候选。实验和理论结合研究表明，含苯并[c]噻吩的BT-NS具有扭曲的分子骨架，对NIR-II FLI具有可接受的QY，对PDT具有出色的ROS生成能力，对PTT具有良好的PCE。利用这些迷人的特性，利用BT-NS NPs成功实现了NIR-II FLI/PAI/PTI三模成像引导的4T1肿瘤小鼠PDT/PTT消除，表现出卓越的治疗效果和良好的生物相容性。可以肯定，这一工作为通过π-桥操纵按需设计多功能NIR-II AIEgens提供了有价值的指导。
参考文献
Thiophene π-Bridge Manipulation of NIR-II AIEgens for Multimodal Tumor Phototheranostics, Yixiong Gui , Yuanwei Wang , Deliang Wang , Yi Qin,Guangjie Song, Dingyuan Yan*, Ben Zhong Tang*, DongWang*，Angew.Chem.Int.Ed.2024,e202318609，https://doi.org/10.1002/anie.202318609
