内容提要
有机近红外(NIR)光闪烁荧光团对于基于单分子定位显微镜(SMLM)的活细胞超分辨率成像是非常理想的。本文介绍了一种新型的发色团PMIP，它是通过苝酰亚胺与2,2-二甲基嘧啶的融合合成的。PMIP在732 nm处具有最大发射峰，在700 ~ 1000 nm波长范围内具有60%的高荧光量子产率，并且在不添加任何添加剂的情况下具有出色的光闪烁性能。利用间苯二酚功能化的PMIP (PMIP- OH)，首次在生理条件下的活哺乳动物细胞中证明了溶酶体的近红外SMLM成像。通过点击化学使用叠氮官能化的PMIP (PMIP- N3)对代谢标记的新生DNA进行特异性检测，从而使磷酸盐缓冲盐水中新生DNA的超分辨率成像具有9倍的空间分辨率提高。这些结果表明基于PMIP的近红外闪烁荧光团在SMLM的生物学应用方面具有广泛的应用前景。
实验结果与讨论
PMIP的设计与合成
邻苯二甲酸亚胺发色团是一类具有良好光学性能的染料，如出色的热和光化学稳定性，高红色和深红色荧光量子产率和生物相容性，对生物成像非常重要。在单分子实验中，苝二甲酰亚胺和涤纶二甲酰亚胺出现了光闪烁现象。它们在活细胞超分辨率成像或生物分子标记和超分辨率成像方面的应用尚未在近红外领域得到报道。我们采用推拉取代，开发了一个小尺寸的近红外荧光团（PMIP），基于苝酰亚胺核与2,2-二甲基嘧啶融合。PMIP在732 nm处显示出最大发射，高近红外为60%，出色的无缓冲闪烁，低开-关占空比为~ 10-3，高光子数(每个闪烁事件)为~ 1800。PMIP可以很容易地功能化并用于SMLM生物成像，显著提高了空间分辨率。在细胞摄取间苯二酚功能化的PMIPOH后，溶酶体在生理条件下的近红外SMLM成像首次在活细胞中得到证实。此外，利用叠氮官能化PMIP (PMIP- N3)通过点击反应，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中成功地实现了代谢标记的新生DNA的超分辨率成像。PMIP的合成通过两步路线。首先，1和苄胺之间的无金属偶联产生2a，产率为70%。随后，在2a的周围位置形成一个六元嘧啶环，以丙酮和三氟乙酸的催化量以75%的收率生产PMIP。用BBr3对3进行甲基裂解得到PMIPOH，产率为60%。为了实现位点特异性标记，在PMIP上引入了一个叠氮函数来生成PMIP- N3。4是按照与PMIP相同的路线合成。随后与BBr3进行甲基裂解，产率为85%。用1,3-二溴丙烷亲核取代5合成6，收率为70%。最后与3-叠氮- N, N-dimethylpropan-1-amine进行Menshutkin反应，以70%的收率制得PMIP-N3。
PMIP的光物理性质研究
PMIP显示吸收和发射最大值λabs和λem分别在660和732 nm处，摩尔消光系数(ε)高，Stokes位移大，为72 nm。与母体3,4,9,10-四氯苝二酰亚胺(λabs = 522 nm和λem = 550 nm)相比，24 PMIP由于分子内电荷转移(ICT)，在吸光度和发射光谱上分别实现了138 nm和182 nm的红移。循环伏安法和密度泛函理论计算也证实了ICT。使用罗丹明800作为参考，在DMSO中的PMIP在700 ~ 1000 nm波长范围内达到了60%的的量子效率，增强了成像性能。与PMIP相比，由于ICT增强，PMIP- OH在700 nm和750 nm处分别表现出λabs和λem的红移。这允许近红外区域的激发和发射，这有利于活细胞和体内成像。PMIP-N3分别在660 nm和730 nm处表现出λabs和λem， 量子效率为58%。荧光相关光谱(FCS)测定了PMIP-OH和PMIP-N3的水溶性两种化合物均可在DMSO中分子溶解，而PMIP- OH和PMIP-N3在水中的水动力学半径(Rh)分别为15 nm和11 nm。由于聚集体足够小，因此对后续SMLM生物成像的影响可以忽略不计。在没有任何添加剂的空气中，研究了PMIP的单分子荧光闪烁特性。PMIP在近红外域表现出优异的突发闪烁。然后，我们测量了开关占空比(分子处于荧光状态的时间比例)和光子数(每次闪烁事件)，这是使用SMLM实现超分辨率成像的关键参数。 PMIP显示出低的开关占空比，约为10-3，表明在衍射限制区域内两个单个分子同时发射荧光的情况很少，因此有助于高定位精度。同时，PMIP显示出高光子数约1800，对应于理论分辨率约10 nm.27PMIP-OH和PMIP-N3也显示出高光子数，分别为1500和1900，开关占空比为~ 10-3。综上所述，基于PMIP的荧光团适合于实现高质量的SMLM成像。
PMIP在活细胞中SMLM成像
为了验证活细胞SMLM成像的概念，U2OS细胞在标准细胞培养基中与PMIP-OH (1 μM)孵育30分钟。细胞摄取后，PMIP-OH选择性地在溶酶体中积累，与LysoTracker Green共定位实验证实了这一点。溶酶体是一种大小为200 - 300纳米的细胞器，其中含有消化酶，用于分解细胞废物(如蛋白质、核酸、碳水化合物和脂质)。因此，它在介导细胞代谢和信号传导中起着重要作用。然而，溶酶体的天然酸性微环境(pH为4.5 - 5)，限制了对pH敏感的有机荧光体的使用在这里，PMIPOH的pH不敏感使得溶酶体的SMLM成像成为可能。因此，我们在近红外区进行了生理条件下溶酶体的活细胞SMLM成像。如图所示，传统的PMIP-OH染色溶酶体的宽场荧光图像呈现出典型的衍射限制图像。相比之下，重建的SMLM图像显示了大大提高的分辨率。此外，以30秒为间隔，对单个溶酶体的实时运动进行150秒的监测，可以在几十纳米的空间分辨率范围内观察形态变化。这些结果证明了基于pmip的闪烁荧光团在近红外区用于活细胞SMLM成像的潜力。
PMIP对DNA标记的SMLM成像
点击化学是核酸领域的有力工具。5-乙基-2′-脱氧尿嘧啶(EdU)是一种胸腺嘧啶类似物，被广泛应用于代谢结合到新生DNA中，随后可以通过点击化学通过叠氮官能化荧光团进行位点特异性检测，这有助于研究细胞增殖和分化，神经发生致癌和细胞周期动力学为了获得新生DNA的超分辨率成像，使用PMIP-N3标记新生DNA。U2OS细胞首先用(2s)-2 ' -脱氧-2 ' -氟-5-乙基尿嘧啶(Fara-EdU)孵育，然后用PBS洗涤。F-ara-EdU可以在复制过程中通过共价键结合到新生DNA链中，具有比通常使用的edu更小的毒性。38随后，裂解细胞，在带正电的玻璃表面提取DNA链，然后将其固定在甲醇/乙酸溶液中。最后，通过点击化学，PMIP-N3检测到新生DNA链上的F-ara-EdU用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，蓝色商业染料，专门标记DNA)共染色。PMIP-N3和DAPI的强共定位，表明PMIP-N3成功标记到新生DNA。用PMIP-N3标记的新生DNA在不添加任何添加剂的PBS溶液中进行近红外SMLM成像。新生DNA链的SMLM图像显示出非常高的分辨率，其FWHM约为60 nm，与传统的宽视场成像(FWHM = 520 nm)相比，提高了9倍。此外，SMLM成像能够清晰区分密集排列的DNA链，具有更高的信噪比，这在传统荧光成像中是具有挑战性的。
结论
我们开发了一种明亮的近红外荧光团，PMIP，其吸收和发射达到近红外区域。PMIP显示出优异的内在光闪烁，具有低开-关占空比(~ 10-3)和高光子数(~ 1800)。作为近红外活细胞实验概念的证明，在生理条件下用PMIP-OH证明了活细胞中溶酶体的超分辨率SMLM成像。代谢标记的新生DNA可以通过PMIP-N3通过点击反应特异性检测，使SMLM成像的分辨率比传统的宽视场成像提高9倍。这些结果表明，基于PMIP的近红外荧光团有潜力扩大SMLM的生物学应用。
参考文献
Near-Infrared Perylenecarboximide Fluorophores for Live-Cell Super-Resolution Imaging,Ze-Hua Wu, Xingfu Zhu, Qiqi Yang, Yulian Zagranyarski, Krishna Mishra, Hilmar Strickfaden,Ronald P. Wong, Thomas Basché, Kaloian Koynov, Mischa Bonn, Chen Li,* Xiaomin Liu,* Klaus Müllen*, J. Am. Chem. Soc. https://doi.org/10.1021/jacs.3c13368
