内容提要
高亮度的荧光有机纳米颗粒(NPs)在要求严格的荧光生物成像应用中具有重要的前景。尽管在开发具有增强性能的新型有机染料方面已经投入了巨大的努力，但提高传统荧光团的亮度仍然是需要克服的最大挑战之一。我们提出了一种超分子策略，用于在水介质中构建超亮荧光纳米颗粒(称为“超荧光团”)。我们采用了一个具有疏水微域的圆柱形纳米颗粒，由环状肽-二嵌段共聚物偶联物在水中组装，作为超分子支架。在支架的疏水微域内，荧光团部分的非共价分散有效地减轻了不希望的聚集引起的猝灭和水引起的荧光猝灭，从而产生高亮度的荧光NPs。这一策略适用于广泛的荧光团，包括多芳烃、香豆素、硼-二吡啶、花青素、杂蒽和方酸。所得的荧光NPs具有高荧光量子产率(>30%)。此外，构建了在近红外区域发射的高性能NPs，其亮度和光稳定性都提高了20倍。我们的超荧光团策略提供了一种多功能和有效的方法，将现有的荧光团转化为水环境中的超亮荧光NPs，用于生物成像等应用。
实验结果与讨论
共轭物合成与自组装表征
为了创建用于组装具有疏水微域的超分子圆柱形组件的超分子间隔，将两亲性二嵌段共聚物连接到环状肽的外围。选择丙烯酸正丁酯(BA)和N, N-二甲基丙烯酰胺(DMA)分别形成疏水和亲水性块。为了调节环肽核周围的疏水区域，采用(RAFT聚合方法合成了具有不同pBA嵌段长度的二嵌段共聚物，得到了3种分散性较窄的二嵌段共聚物，命名为pBA-b- pdma (P2P4)。此外，还合成了一种缺乏疏水性pBA嵌段的均聚物作为对照(pDMA, P1)。随后，通过HATU偶联化学将P1-P4偶联到含氨基环肽上，得到间隔物S1-S4。同时，选择Cyanine 5作为模型染料附着在同一环肽上，得到CP-Cy5作为超分子发射器。利用小角中子散射(SANS)对4种超分子间隔剂在水中的自组装结构进行了表征。通过将S1-S4和CP-Cy5以特定的摩尔比在水溶液中共组装，可以很容易地构建出荧光超分子组装体，称为Supra-Cy5。
不同隔离剂构建supera -cy5的光物理性
研究了不同超分子间隔剂构建的supera-Cy5的光物理性质。将CP-Cy5 (Emitter)的浓度保持在4 μM不变，同时将S2与不同的摩尔当量进行共组装。由于明显的ACQ, CP-Cy5本身的荧光被完全猝灭。发射强度随间隔极/发射极摩尔比的增大而增加。在10/1的比例下，荧光增强达到180倍，在40/1的比例下稳定在约250倍。在紫外/可见光谱结果中，Cy5在组装体中的聚集状态发生了明显的变化。Spacer/Emitter摩尔比的增加导致Cy5在650 nm处的吸收增加，表明在S2的帮助下Cy5部分被空间分离。为了定量比较4种Spacers构建的supera -Cy5的性能，进行了荧光量子产率和亮度的测量，都随着4种间隔剂/发射器摩尔比的增加而增加。同时，疏水性pBA片段的存在对Supra-Cy5的性能起着重要的作用。在间隔与发射摩尔比为10/1时，S1形成的supera-cy5的量子产率是16.7%。使用S2生成的supera-Cy5的亮度显著提高，提高了2.2倍。随着pBA段长度的增加，亮度进一步增加，S3和S4的亮度分别为46060 M-1 cm-1 (ΦF =33.6%)和43150 M-1 cm-1 (ΦF =29.9%)。在间隔/发射摩尔比为10/1时，Supra-Cy5的发射最大值随着疏水pBA块段长度的增加而逐渐发生色移(高达11 nm)，这表明Cy5在组件内的微环境发生了变化。
Supra-Cy5表现出显著的稳定性，这要归功于环肽之间强的多重氢键相互作用。首先，我们评估了Supra-Cy5在水中长时间的稳定性。6天后荧光强度仅下降8.5%。其次，supera - cy5在广泛的水介质中表现出优异的稳定性。这确保了Supra-Cy5适用于各种生物相关应用。再次，研究了Supra-Cy5的浓度稳定性。在Cy5浓度范围内(从50 μM到0.39 μM)，Supra-Cy5没有发生聚集或分解。最后，对supera - cy5的固态光物理性质进行了表征。固态supera - cy5的激发和发射光谱与在水中获得的几乎相同，同时ΦF值高达33.2%。总的来说，这些结果强调了Supra-Cy5在水介质和固态中的令人印象深刻的稳定性。为了展示Supra-Cy5在生物成像方面的潜力，活的CT26结直肠癌细胞分别与Supra-Cy5或Cy5孵育，并在相同的实验条件下使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)成像。由S3构建的Supra-Cy5与由S1构建的Cy5或Supra-Cy5相比，荧光明显更亮。为了进一步阐明supera - cy5的细胞内定位，我们使用了另外两种细胞探针:LysoTracker Green用于标记溶酶体，Hoechst 33342用于标记细胞核。显示了Supra-Cy5和LysoTracker Green信号之间有明显的重叠，而Supra-Cy5和Hoechst 33342之间没有明显的重叠。这表明Supra-Cy5通过内吞作用进入细胞而不干扰细胞核。这些实验证实了Supra-Cy5卓越的亮度和稳定性使其成为生物成像应用中荧光探针。
扩展到六类有机荧光团
为了在更广泛的背景下测试我们的超分子策略的有效性，我们计划研究6种不同类别的常见有机荧光团。这些类别包括多芳烃(PAHs)、香豆素、硼-二吡咯烯(BODIPYs)、花青素、杂蒽和方酸。选用DPA、Cou343、BDP_FL、Cy3、RhB和SQ分别代表多环芳烃、香豆素、BODIPYs、花青素、杂蒽和方酸。这6个荧光团的发射光谱跨越整个可见波长范围。与Supra-Cy5相同的方法，通过将各自的发射体与S3在水中共组装来制备Supra-Cy5。随着间隔材料/发射材料摩尔比的增加，它们的发射强度都呈现出相似的增加趋势，类似于Supra-Cy5。当垫片/发射器的摩尔比为10/1时，它们的ΦF和B值均达到了令人满意的水平，范围分别为17.1%至33.5%，4400 M-1 cm-1 至34690 M-1 cm-1 。所有超荧光团在紫外灯下显示出明亮的荧光。当将超荧光团与其小分子对应物进行比较时，在吸收和发射光谱中都观察到明显的变化，证实了荧光团位于由组装提供的不同微环境中。对固态超荧光团的光物理性质进行了表征，它们不仅与水中的超荧光团具有相同的荧光激发和发射光谱，而且具有高荧光量子产率。因此，我们成功地在溶液和固体状态下获得了一系列高发射度的超荧光团，覆盖了蓝色、青色、绿色、黄色、橙色、红色和红木色等可见颜色。将Supra-DPA、Supra-BDP_FL、Supra-Cy3和Supra-SQ的水溶液装入商用喷墨打印机的墨盒中，在紫外灯下呈现出明亮的蓝、绿、黄、红四种荧光。
具有高亮度和光稳定性的超近红外染料
近红外有机染料在生物成像中发挥着至关重要的作用，因为它们在近红外区域提供成像能力，实现深层组织穿透，减少自身荧光，最小的光损伤，然而，大多数常见的近红外有机染料都存在荧光量子产率低和光稳定性差的问题。因此，开发具有更高量子产率和光稳定性增强的近红外染料无疑将推动光成像领域的发展。选择了两种最广泛使用的近红外染料Cy7和ICG。将CP-Cy7和CP-ICG分别与S3在水中共组装制备了Supra-Cy7和Supra-ICG。与水中的游离Cy7和ICG相比，Supra-Cy7和Supra-ICG的吸收光谱和荧光光谱都出现了>10 nm的红移。当Spacer/Emitter的摩尔比设置为20/1时，supera - cy7和supera - icg的ΦF值分别达到了25.1%和8.9%的显著水平。当摩尔比调整为40/1时，这些值进一步增加到27.7%，为9.7%。然后研究了Supra-Cy7和Supra-ICG的光稳定性。经过30分钟的光照射，70%的Cy7光漂白，而Supra-Cy7光漂白率仅为22%。与ICG相比，SupraICG的光稳定性显著提高了22倍。我们的超分子策略为制备具有高亮度和光稳定性的近红外荧光NPs提供了一种有效的方法。
结论
我们报告了一种从传统荧光团制造超亮荧光NPs的超分子方法。通过采用具有疏水微结构域的独特圆柱形纳米颗粒作为超分子支架，同时防止ACQ和荧光团水的荧光猝灭。这使得在水介质中组装一系列超亮超荧光团变得容易。该方法已被证明在构建超近红外荧光团时特别有效，其特点是特殊的亮度和出色的光稳定性。人们高度期待超荧光团方法为推进荧光生物成像技术提供了重要的希望，为荧光有机纳米颗粒领域提供了一个新的维度。
参考文献
Supra-Fluorophores: Ultrabright Fluorescent Supramolecular Assemblies Derived from Conventional Fluorophores in Water, Yuqing Lei, Yuqian Wang, Sophie K. Hill, Zihe Cheng, Qiao Song*, and Sébastien Perrier*, ADV MATER，https://doi.org/10.1002/adma.202401346
