内容提要
卓越的光稳定性，最小的光毒性，红移吸收/发射波长，高亮度和扩大的斯托克斯位移是顶级有机荧光团的基本特征，特别是对于活细胞的长期超分辨率成像。本研究展示了一种通过引入9,9-二甲基-9,10-二氢吖啶(DMA)作为电子给体同时增强这些性能。DMA不仅可以诱导发射波长的红移，还可以抑制基于DMA的荧光团的光氧化反应，防止三重态的形成，从而大大提高光稳定性，显著降低光毒性。DMA基团增强了荧光团的亮度，扩大了斯托克斯位移。并成功地使细胞器和halotag标记的膜蛋白的STED成像。
实验结果与讨论
理论计算
9,9-二甲基-9,10二氢吖啶(DMA)部分提供了一个广泛的共轭系统，由于额外的共轭苯环。DMA的扩展共轭可以有效地使氮原子上的电子密度离域，大大提高了抗氧化性。DMA的环状结构限制了氨基的旋转。这两个甲基的位阻效应进一步抑制了蝴蝶的运动，这与PTZ部分观察到的行为相反。因此，我们预计DMA用于荧光团(i)由于其广泛的偶联性而显着延长λabs/λem;(ii)由于分子结构相对刚性，保持较高的荧光量子产率;(iii)由于蝴蝶运动的特定程度而扩大斯托克斯位移，以增强几何松弛;(iv)由于提高了抗光氧化性，提供了高的光稳定性。为了支持我们的假设，我们进行了大量的量子化学计算来比较罗丹明B、THQ -罗丹明(THQ-SY)和DMA -罗丹明(DMAR-SY)的几何和电子结构。前沿分子轨道分析表明，DMAR-SY中的融合苯基环有效地扩大了π共轭，从而将电子间隙减小到4.675 eV，而Rhodamine B中的电子间隙为4.988 eV。DMARSY (473.5 nm)比Rhodamine B (437.8 nm)有明显的红移。与Rhodamine b相比，THQR-SY表现出λabs/λem的红移以及较大的Stokes位移。这些光物理性质主要归因于引入了两个额外的氨基供体，这使得HOMO能级不稳定，减少了电子间隙，并大大增强了分子内电荷转移(ICT)。考虑到光化学反应通常发生在三重态(长寿命)而不是单线态(短寿命)，我们预测了DMAR-SY，罗丹明B和THQR-SY的三重态形成产率。DMAR-SY的单重态(S1)和紧密相连的三重态(T1或T2)之间的自旋-轨道耦合(SOC)值远小于THQR-SY (0.21 cm−1)。虽然罗丹明B的SOC (0.03 cm−1)与DMAR-SY相当，但罗丹明B易受扭曲分子内电荷转移(TICT)的影响。这种稳定的TICT状态可以进一步最小化ΔEST，增强SOC，并促进罗丹明B中的三重态形成这些结果表明，在这三种化合物中，DMAR-SY进入三重态的概率最低，这反过来又有助于其优越的光稳定性和最小的光毒性。我们通过评估这些化合物在乙醇中的电离势进一步评估了它们在激发态下对光氧化的敏感性。DMAR-SY (3.77 eV) > Rhodamine B (3.65 eV) > THQR-SY (3.55 eV)，表明DMA-rhodamine具有最高的光氧化抗性，这种强抗氧化性以及低三态生成率可以赋予DMA -罗丹明良好的光稳定性。我们还扩展了我们的计算，包括更多的dma -二氟硼配合物和dma -香豆素。我们的计算表明，所有这些化合物都具有红移λabs/λem，大的Stokes位移，良好的量子产率和光稳定性。这表明了DMA部分作为一种给电子的生长素来改善各种有机荧光团的光物理性质的潜在普遍性。
DMA基罗丹明的合成与光物理性质
以3-甲氧基苯胺为原料，分多步制备了甲氧基(DMA- ome)和羟基(DMA−OH)取代基的DMA衍生物。DMA−OH与邻苯二酸酐在甲磺酸中缩合，生成了对称的DMAR-SY，收率为23%。无色无荧光为了防止内酯的形成，我们将羧基酯化得到了一系列衍生物。与罗丹明B和C4R(氮啶取代罗丹明)， DMAR-SY和DMAR-SY在乙醇中的紫外-可见-近红外吸收(>50 nm)和荧光峰(≥100 nm)发生了显著的红移。DMAR-SY和DMAR-SY的斯托克斯位移(66 nm)明显大于罗丹明B (19 nm)和C4R (22 nm)。在不对称的DMA -罗丹明染料中也观察到这些大的色移。不对称DMA-罗丹明染料的斯托克斯位移(高达77 nm)略大于对称DMA - sy的斯托克斯位移(66 nm)。这些较大的斯托克斯位移可能归因于非对称罗丹明中电荷转移的增强和与对称罗丹明相比更大的S1偶极矩。所有的DMA -罗丹明都表现出很高的荧光量子产率，在乙醇中从0.23到0.49不等。对称的DMAR-SY和DMAR-SY的量子产率分别为0.29和0.23。不对称的罗丹明染料比对称的有更高的量子产率。DMAR-Julo表现出0.49的高量子产率，这归功于分子结构的良好刚性。与传统罗丹明一样，所有DMA -罗丹明具有较大的摩尔吸收系数。这些染料的荧光亮度与罗丹明B相当。DMAR-Julo和DMAR-Julo的亮度甚至比罗丹明B高，分别高出169和159%。
DMA基罗丹明染料的光稳定性
将DMA-罗丹明的光稳定性与THQ -取代类似物和罗丹明B进行比较。我们考察了具有相似光学性质的THQ-SY和DMAR-SY的光稳定性。我们在635 nm激光照射(300 mW)下监测了这两种罗丹明在三氟乙醇中的吸光度变化。通过调整染料浓度，使两种样品在635 nm处的吸光度相等，以确保它们吸收相同数量的光子以进行比较。光照40min后，DMARSY的吸光度仅变化2%，DMAR-SY溶液的颜色几乎保持不变。光照10分钟后，THQR-SY表现出明显的降解，紫外可见吸收光谱从598 nm蓝移到573 nm蓝移。光照30min后，吸光度峰值下降50%，达到平稳期。因此，THQR-SY溶液的颜色明显褪色。通过将吸光度数据拟合到指数方程，THQR-SY的速率常数(kbs)为0.172 min−1,DMAR-SY为0.022 min−1。DMAR-SY的荧光光谱在光照40分钟后也表现出最小的变化。THQRSY的荧光强度迅速下降，直到在照射40 min内几乎完全熄灭(λex = 635 nm;)。THQR-SY的荧光衰减速率(kfl = 0.104 min−1)比DMAR-SY (kfl = 0.0007 min−1)快150倍。我们还比较了酯化染料DMARE-SY和THQRE-SY的光稳定性，发现DMARE-SY具有相似的光谱稳定性。光照40 min后，DMARE-SY和THQRE-SY的吸光度峰值分别下降了2%和67%。DMRE-SY的荧光变化(几乎没有变化)和THQRE-SY(几乎完全消失)进一步支持了dmre - sy的稳定性。我们使用500 W氙灯光源将类似的光稳定性研究扩展到所有DMA/ thq -罗丹明对。与相应的thq染料相比，所有基于dma的染料都表现出更大的光稳定性。DMA -罗丹明的吸光度和荧光强度保持稳定。照明160 min后，thr rhodamines的吸光度损失为23% ~ 75%。同样，它们的荧光损失也超过80% (THQR-SY和THQRE-SY的荧光损失高达90%)。这些染料的光稳定性顺序为:DMArhodamines > Rhodamine B > THQ-rhodamines。
DMA基罗丹明染料在活细胞中的光稳定性
由于DMA -罗丹明染料具有出色的亮度和光稳定性，我们选择DMAR-SY和DMAR-DE作为代表，以罗丹明B、THQR-SY和THQR-DE为参考，评估它们在活细胞成像中的性能DMAR-SY染色后，细胞在共聚焦显微镜下显示出强烈的荧光信号。DMAR-SY培养细胞的荧光信号在共聚焦成像过程中保持稳定，在激光照射140 min (565 nm)。THQR-SY在相同的实验条件下显示出~ 75%的荧光损失。同样，罗丹明B(在565 nm激光照射下)在照射140 min后的信号损失约为55%。这些结果表明，DMArhodamine染料在生物环境中具有良好的光稳定性。在共聚焦成像结果的激励下，我们探索了DMA-罗丹明在STED纳米显微镜下的应用(激发光:2 W/cm2;耗尽激光器:660 nm, 50 MW/ cm2)。我们观察到660和775 nm耗尽激光器对STED成像都是有效的。我们有目的地采用660 nm耗尽光束来加速光漂白，这有助于光稳定性的比较分析。对于需要长时间成像的应用，我们建议使用775 nm耗尽激光器，因为它可以降低光漂白率。在光照20分钟后，DMAR-SY的荧光强度仅下降了约25%，荧光衰减率常数k = 0.048 min-1。然而，在相同的实验条件下，THQR-SY在辐照5分钟(k = 0.668 min-1)后就完全光漂白，并且在活细胞中褪色速度比DMAR-SY快14倍。同样，市售的罗丹明染料，罗丹明B和Atto565，在实验20分钟后，荧光强度显着下降，分别超过68% (k = 0.085 min-1))和78% (k = 0.183 min-1)。这些减少明显大于DMAR-SY。在另一组(DMAR-DE、THQR-DE、Rhodamine B和Atto565)中也观察到相同的光稳定性趋势。DMAR染料在活细胞的荧光和STED成像中也表现出优异的性能，表明它们在超长延时成像中具有很大的应用前景。我们选择了具有代表性的DMA -罗丹明染料DMAR-DE，以评估其在STED纳米显微镜下的成像分辨率。DMAR-DE成功定位了线粒体嵴，揭示了其精细结构。STED图像的分辨率约为190 nm，清晰地描绘了线粒体嵴群。此外，DMAR-DE染色细胞的复杂线粒体结构在至少30分钟内仍然可见。这一观察结果表明，DMAR-DE不仅表现出良好的光稳定性，而且在STED成像过程中对细胞的光毒性最小。
DMA基罗丹明染料在活细胞中光细胞毒性
我们使用经典的MTT法在黑暗环境中测试了基于dma的罗丹明的细胞毒性。结果表明，它们在活细胞中的细胞毒性可以忽略不计。为了进一步量化基于dma的罗丹明的光毒性，我们以各自的最佳激发波长连续照射负载荧光团的HeLa细胞30分钟，罗丹明B和THQR-SY处理的死亡细胞百分比分别约为40%和50%，远高于DMAR-SY 染色的细胞(19%)。DMAR-DE、罗丹明B和THQR-DE也观察到类似的趋势，在光照30分钟后分别导致21%、40%和51%的细胞死亡。这些结果表明，与罗丹明B和thq修饰的荧光团相比，dma修饰的罗丹明显著降低了对活细胞的光细胞毒性。光毒性的降低可归因于ROS的减少，因为光细胞毒性源于光诱导的单线态氧，它触发各种ROS损伤细胞这一定量测量与我们的理论计算和体外测试一致，并进一步说明了DMAR染料的光细胞毒性最小化的能力。
双色STED显微镜用于细胞器相互作用成像
为了研究胞内细胞器的相互作用，我们应该提高基于DMA的荧光团对细胞器特异性成像的选择性。我们首先以量子产率最高的DMAR-Julo为原料，通过连接一个酯化十八烷基链制备了DMAR-C18。DMAR-C18不仅具有DMAR-Julo的光稳定性、光毒性降低、亮度高、Stokes位移大等优点，而且提高了DMAR-Julo的膜穿透性。DMARC18进入线粒体基质，商用线粒体内膜跟踪器证实了这一点。研究表明，LDs是高度动态的，可以与细胞中的线粒体发生物理相互作用，特别是在那些具有高脂肪酸储存和氧化应激的细胞中，如脂肪细胞、肝细胞和骨骼肌细胞研究线粒体和LDs之间的相互作用将大大增强我们对参与能量和质量传递的细胞网络的理解，并为代谢疾病的干预提供新的见解。我们利用DMAR-C18和DMACou-BI进行双色成像实验，动态观察线粒体与LDs的相互作用。与共聚焦成像相比，高分辨率STED成像被证明更有利于检查细胞器相互作用。在放大区域，共聚焦成像不准确地提示LDs和线粒体之间的相互作用。然而，STED纳米显微镜显示它们相隔约160 nm的距离。为了增加线粒体- LD相互作用，将饥饿细胞(在无血清培养基中)用于成像。在持续跟踪33min的实验过程中，DMAR-C18(红色)和DMACou-BI(绿色)的荧光信号基本保持不变。有趣的是，我们观察到LD(绿点A)和线粒体(红点B)在密闭区域(21分钟内)来回移动;LD的运动轨迹比线粒体长。21 min时，LD (A)与线粒体(B)接触，并在21 ~ 30 min期间重叠(30 min时黄色点C);然后点C移出视场。这些结果进一步证明了基于dma的荧光团是高度稳定的，可以通过长时间的超分辨率成像来研究细胞器及其相互作用。
卤化标签融合膜的STED成像
我们探索了基于DMA的荧光团用于蛋白质标记的潜力，使通过STED纳米显微镜跟踪蛋白质动态成为可能。HaloTag是一种在细胞研究中广泛应用的自我标记技术。因此，我们将HaloTag配体偶联到DMA-罗丹明荧光团中，获得新的探针DMAR-HT。为了验证DMAR-HT的蛋白标记效果，我们在体外进行了凝胶内分析。探针与HaloTag7蛋白在PBS缓冲液中孵育1小时。接下来的凝胶内标记实验显示，HaloTag7蛋白有很强的荧光信号，这显然肯定了DMAR-HT对HaloTag7蛋白的选择性结合能力。然后我们开始用DMAR-HT进行细胞标记实验。我们用融合了绿色荧光蛋白(GFP)和HaloTag蛋白的跨膜结构域转染293T细胞，然后用DMAR-HT孵育细胞。结果发现，DMAR-HT与膜蛋白融合GFP的荧光信号明显重叠(PCC = 0.92;)，表明DMAR-HT在细胞膜上有效定位。这一结果明确地证明了DMAR-HT对活细胞中halotag融合蛋白的选择性亲和力。此外，STED图像的分辨率远高于共聚焦图像。制备了一种与罗丹明B结合的HaloTag配体Rh-B-HT作为对照化合物，以评价DMAR-HT的光稳定性。如图所示，dmarht染色的转染细胞在连续暴露于STED纳米镜下时表现出显著的光稳定性。即使在照射40分钟后，DMAR-HT的荧光强度也只减少了22%。Rh-B-HT组仅在照射20分钟后信号完全消失。这种优越的光稳定性强调了DMAR-HT的能力，以促进延长的时间推移可视化的蛋白质，即使在超分辨率显微镜的苛刻的环境。
结论
我们已经证明了基于DMA的罗丹明，二氟化硼配合物和香豆素具有优异的光稳定性，最小的光毒性，延长的紫外-可见吸收和发射波长，大的斯托克斯位移和高量子产率。这些有利的性质主要归因于最小的三重态形成和强大的抗氧化反应，在保持高量子产率的同时增强Stokes位移。该类荧光染料优异的光稳定性为在活细胞中进行超分辨率成像提供了广阔的前景。
参考文献
Auxochrome Dimethyl-Dihydroacridine Improves Fluorophores for Prolonged Live-Cell Super-Resolution Imaging ,Xiaojie Ren, Chao Wang, Xia Wu, Mengtao Rong, Rong Huang, Qin Liang, Tianruo Shen, Hongyan Sun, RuilongZhang*, Zhongping Zhang, Xiaogang Liu*, Xiangzhi Song*, and James W. Foley,J. Am. Chem. Soc.，https://doi.org/10.1021/jacs.3c11823
