内容提要
近红外第二窗口小分子荧光团(NIRII, 1000 - 1700 nm)由于在高空间分辨率的深层组织成像方面取得重大突破而受到广泛关注，构建NIR-II荧光支架的策略仍然非常有限。我们报道了一种基于分子内电荷转移机制的具有大斯托克斯位移的NIR-II波长发射荧光染料，即二苯基氨基吖啶(DPA)染料的途径。DPA具有可调谐的光学特性，最大吸收/发射波长为900 nm和1085 nm。它们对光漂白和氧化都有很高的耐受性。高分辨率的活体胃肠道显示了其在生物成像中的巨大的应用前景。本研究为构建NIR-II小分子荧光支架提供了一条有前景的途径。
实验结果与讨论
DPA染料的合成
DPA染料首先采用叔丁基羰基(Boc)保护原料2,7-二溴-9,9-二甲基9,10-二氢吖啶的胺部分。然后，取代或未取代的二苯胺和boc保护的二氢吖啶通过Buchwald-Hartwig交叉偶联反应生成荧光前体2a-2f，最后，用三氟乙酸处理这些荧光前体，得到相应的荧光团DPA-1-DPA-6。对这些DPA染料在不同溶剂中的光谱特性进行了研究。DMSO的最大吸收波长在755 ~ 845 nm范围内，最大发射波长在985 ~ 1050 nm之间，在200 nm以上有较大的Stokes位移。当取代的二苯胺给电子能力增加时，可以观察到近100 nm的吸收波长和70 nm的发射波长的显色位移。
发光机制及其稳定性研究
不寻常的长发射波长和大的斯托克斯位移促使我们探索NIR-II的发射机制。我们使用高斯程序在B3LYP/6-311G (d, p)水平上进行量子化学计算，以研究二苯胺取代对DPA染料电子和几何性质的影响。DPA染料具有近似的能隙和f值，比具有相同骨架但有甲基取代基的化合物7的能隙更小。电荷分析表明，化合物的大部分正电荷(0.60 e)位于二苯胺取代基上，0.40 e位于吖啶核心上，但在吖啶上观察到0.58 e，在甲基取代基上观察到0.42 e)。所有垂直激发能(S0/S1)都与给电子基团紧密相关，从而缩小了DPA染料的HOMO-LUMO间隙。结果表明，DPA染料可以通过在二苯胺取代位置进行简单的R官能团修饰进行微调。然后获得DPA-1的优化基态(S0)和第一单重态激发态(S1)几何形状。苯环与吖啶部分的二面角变化明显，从基态的62.4到激发态的19.5。因此，我们有理由推测DPA染料在激发态的构象比在基态的构象更趋于平面化。然后利用瞬态吸收光谱研究DPA-1的激发态动力学。在365 nm激发下，DPA-1在NIRII光谱区有850 ~ 1100 nm的受激发射(SE)带。随着时间的推移，850 nm左右的SE峰减小，1000 nm左右的SE峰增大，这可能是由扭转态向平面化转变的过程。为了进一步验证波长与相应的二面角之间的关系，研究了DPA-3对温度和粘度变化的光谱响应。据报道，低温和高粘度通常会导致分子内振动受到限制，不利于平面化的形成。由于二面角的变化，DPA-3的最大发射波长从77 K逐渐增加到200 K。同样，在H2O和甘油混合溶剂中，DPA-3的相对波长随着粘度的增加而逐渐减小。因此，这些发现证明了长波发射与两个平面的可旋转二面角密切相关。综上所述，这些计算和实验结果令人信服地证明了DPA染料在激发态下的显色荧光发射和大Stokes位移应归属于PLICT过程。
随后，将DPA染料的光稳定性与临床批准的吲哚菁绿(ICG)进行比较。将溶液中的DPA染料和ICG暴露在808 nm激光照射下(0.5 Wcm2)。连续照射50min后，ICG的最大吸收量几乎完全被光漂白。但DPA-2 - DPA-5几乎没有衰减，DPA-1仅衰减17%，DPA-6仅衰减8%。这些结果表明DPA染料比ICG染料具有更好的光稳定性。此外，DPA染料还表现出优异的化学稳定性。对DPA染料(10mm)进行超氧化钾、过氧化氢、次氯酸钠等多种常见活性氧处理后，其吸收光谱无明显变化。以次氯酸钠为例，商用染料(如ICG、IR1061和IR26)的吸收光谱在0 ~ 50 mM范围内发生了严重的漂白，而DPA染料在50 mM氢氧化钠的作用下吸收光谱仍保持不变。为了使DPA染料在生物医学应用中具有水溶性，我们通过共价修饰引入了两个磺酸基团，得到了DPA- 2SO3H。与其他DPA染料一样，DPA- 2SO3H在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的最大吸收波长为810 nm，最大发射波长为1022 nm, Stokes位移较大，为212 nm。令我们欣喜的是，与ICG相比，DPA-2SO3H在pH = 2的PBS中仍然显示出强烈的荧光发射(类似于胃酸)，表明其对酸性环境具有较高的抗性。
生物成像应用
我们进一步利用这些荧光团探索生物成像在体内的应用。据我们所知，目前已有的NIR-II荧光团已广泛应用于血管、肝、肾、脑、肺、等成像。然而，由于酸性环境和酶的作用可能导致大多数成像试剂在胃肠道生理范围内的荧光猝灭，因此通常不进行胃肠道的NIR-II功能成像，如蠕动和分割。上述DPA染料的光化学稳定性和高耐酸性表明，这类新的NIR-II荧光团在胃肠道中具有重要的潜力。基于此，我们建议采用DPA染料对胃肠道进行NIR-II成像。在成像应用之前，我们首先通过体外标准细胞计数试剂盒-8检测和小鼠体内主要器官的H&E染色评估了DPA- 2SO3H的潜在毒性，未观察到明显的毒性。将DPA-2SO3H直接口服于健康雌性BALB/c小鼠，对其进行胃肠道NIR-II成像。当SBR为57.8时，小鼠胃立即被点亮。DPA-2SO3H在胃、十二指肠、回肠等胃肠道蠕动中以高分辨率清晰地观察到动态运动过程。随后，对灌胃DPA-2SO3H后的小鼠腹部视图进行肠蠕动视频速率和分割动态成像。肠道动态过程清晰可见，在肠道疾病的临床诊断中具有巨大的应用潜力和价值。因此，DPA-2SO3H可以作为一种简单而强大的工具，用于体内无创的胃肠道NIR-II功能成像。结果显示盐酸噻嗪麻醉小鼠可抑制肠道蠕动，表明DPA-2SO3H可作为评估药物对胃肠道作用的有效工具。此外，DPA-2SO3H在区分肠梗阻小鼠和健康小鼠方面也显示出很大的潜力。作为一项概念验证实验，DPA染料在高SBR的生物成像中具有巨大的潜力。
结论
我们报道了一类基于PLICT机制的NIR-II荧光基团支架DPA。DPA染料显示NIR-II荧光发射和大的Stokes位移，适合体内成像。这些染料还表现出优异的光稳定性和化学稳定性，特别是对氧化物和酸的高抗性，可用于复杂生物系统的生物成像应用。生物成像结果显示水溶性DPA-2SO3H可以提供清晰、高分辨率的胃肠道成像。这项工作为创建针对各种成像应用的NIR-II荧光团支架提供了一个范例，因此在探索新的NIR-II荧光团支架方面具有吸引力。
参考文献
