内容提要
本研究介绍了三种新型共轭电解质(CE)分子的设计和合成，它们在第二个近红外窗口(NIR-II)中发射，促进更深的组织穿透。这些CE作为脂质双分子层的仿生物，与常用的碳菁染料(如DiR)相比，与脂质膜具有更好的相容性。为了抵消聚集引起的猝灭效应，CE采用了扭曲的主链，因此在荧光团聚合策略后，它们的荧光强度可以有效地增强。在脂质体形成过程中，采用“被动”方法将CE整合到脂质体中，明显提高了膜掺入效率，接近100%。为了验证体内跟踪能力，我们用环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)肽功能化了含CE的脂质体，作为肿瘤靶向配体。通过收集NIR-II辐射，获得了活体小鼠肿瘤部位清晰的荧光图像。这些CE在可见光区表现出额外的发射峰，使得使用常规共聚焦显微镜进行体外亚细胞分析成为可能。这些结果强调了CE作为新一代膜靶向探针促进脂质体药物研究的潜力。
实验结果与讨论
CE的合成和光物理性质研究
BBT是最近报道的一种NIR-II CE分子，但它在膜内存在明显的ACQ效应，阻碍了荧光强度的增加，这可能是由于它的刚性和平面骨架。我们设计并合成了两个以苯并双噻二唑为基础的片段分子，并偶联了两个噻吩(BBT-T)或EDOT (BBT-EDOT)单元。从单晶结构上看，BBT-T在苯并双噻二唑和噻吩单元之间呈二面角为2°的平面结构，相邻分子平面之间的层积距离为3.4 Å。与之相比，用EDOT取代噻吩后，二面角明显增大至53°，BBT-EDOT的分子堆叠间隔也增加到4.7 Å。这表明EDOT单元具有减少分子聚集和随后减轻荧光猝灭的潜力。不幸的是，扭曲的拓扑结构会阻碍有效的共轭，在甲苯中，BBT-EDOT的吸收光谱(116 nm)和发射光谱(163 nm)相对于BBT-T的蓝移就证明了这一点。为了解决这些缺点并减少光学带隙，将含有edot的CE的主链长度扩展到9个芳香环。所有的CE在可见光和近红外区都有吸收带。通过测定它们的吸收边，在1.30 ~ 1.33 eV范围内发现了相似的光学带隙。虽然由供体-受体-供体(D-A-D)“翅膀”组成，但EFBT (762 nm)在近红外区域的最大吸收波长(λmax)最小，而EPV (777 nm)和EBen(775 nm)的吸收波长最小。在808 nm激发时，BBT在1006 nm处观察到发射峰，而三个新CE的红移峰更多(1077-1095 nm)。在405 nm激发后，CE在可见光区表现出额外的发射带，相对于它们的“翅膀”前体具有显著不同的荧光谱。随着“翼”共轭长度的增加或D-A-D结构的引入，可见光发射光谱逐渐红移，表明可见光发射波段取决于“翼”的带隙。这些双发射现象可能是由于“翼”与“核”之间耦合不良，导致“翼”的高能激发态不能完全转移到低带隙的“核”。在甲苯中测量的具有相同共轭骨架的中性中间体中也观察到类似的趋势。超滤实验表明，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的CE溶液可以有效地通过平均孔径约为11 nm的100 K分子量截流(MWCO)膜，证明CE在水溶液中不会形成纳米聚集体。
Ce与脂质膜的作用研究
我们进一步详细研究了CE与脂质膜的相互作用。大单层囊泡(LUVs)由中性磷脂1-棕榈酰-2-油基-甘油-3 -磷脂胆碱(POPC)和/或带负电荷的1-棕榈酰-2-油基- n-甘油-3磷酸-(1 ' -丙基甘油)钠(POPG)组成，用聚碳酸酯膜挤压制成模型脂质膜。首先使用吸收光谱和PL光谱测量luv中CE的光物理性质。膜插接后，所有的CE都表现出与甲醇相似的吸收谱，但EPV、EBen和EFBT的近红外峰分别红移到852、827和825 nm。通过在405 nm和820 nm处激发含CE脂质体，分别在可见光区和NIR-II区记录了两个发射峰。与吸收测量中发现的趋势相反，在新的CE分裂成膜后，近红外发射峰蓝移到1017-1037 nm。这些CE是荧光膜靶向探针。由于高介电水性环境，PBS中的纯EBen的发射可以忽略不计。在LUV存在的情况下，EBen的共轭荧光团浸入LUV双层的疏水区域，与水接触较少，导致其PL强度大幅增加。可见发射峰显著增加，这明显高于先前报道的发射波段在500 nm左右的CE。在365 nm紫外灯下拍摄添加LUV后CE的荧光信号响应。在CE和LUV浓度相同的情况下，EPV和EBen比BBT表现出更明显的荧光。在蛋白质的存在下进一步检查了荧光特性。我们评估了这些CE的ACQ效应，以研究是否可以通过在脂质体中加载更多的荧光团来提高荧光亮度。1 mM带负电的脂质体可以完全容纳至少32μM的CE。当染料浓度超过6 μM时，BBT的荧光强度开始降低。当探针浓度增加到32μM时，新CE的荧光强度逐渐增加。这种现象可能是由于扭曲的骨干减轻了ACQ的影响。为了评估CE插膜后的囊泡形态，我们对采用0.1 μm聚碳酸酯膜挤压的1 mM luv进行了基于DLS测量的生物物理实验。在5 μM新CE处理后，尺寸分布曲线没有明显变化， z -平均值和多分散性指数(PDI)值保持在一个接近的范围内，表明这些CE对膜形态的影响很小。CE的正电荷可以显著改变luv的表面电位。在去离子水中使用10 μM EBen处理后，基于100%中性POPC的1 mM luv测得43 μ 1 mV的高zeta电位。这种不利影响可以通过平衡正CE和负脂质的比例来简单地消除，这甚至提供了一种根据需要调整囊泡表面电位从正到负的方法。
采用HEK293T细胞法和细胞计数试剂盒 (CCK-8)法评价CE的体外细胞毒性。首先通过使用吸收光谱测量上清液中的CE浓度来检测细胞摄取的定量分析。HEK293T细胞在37℃下孵育2小时后，EPV、EBen和EFBT的摄取率(包括细胞表面关联)分别为52%、56%和54%。为了进一步了解细胞与CE之间的相互作用，利用传统共聚焦显微镜进行亚细胞分析，在405 nm处激发，并收集450-550 nm范围内的可见发射。EBen染色10 min后可见HEK293T细胞边界的荧光图案，提示EBen一开始就对细胞膜进行了染色。相对较弱的荧光表明EBen缓慢地嵌入活细胞。EBen与细胞共孵育24小时后，EBen被细胞内化。因此，使用市售的细胞染色剂进行共定位实验，以揭示EBen在细胞内的积累。使用CEllMask Deep Red FM和SYTO 59 Red(购买于Invitrogen)跟踪细胞。采用HEK293T细胞法和细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)法评价CE的体外细胞毒性。首先通过使用吸收光谱测量上清液中的CE浓度来检测细胞摄取的定量分析。HEK293T细胞在37℃下孵育2小时后，EPV、EBen和EFBT的摄取率(包括细胞表面关联)分别为52%、56%和54%。三种CE的半数最大抑制浓度(IC50)值均大于100 μM。当细胞系切换为4T1或3T3细胞时，观察到类似的结果。为了进一步了解细胞与CE之间的相互作用，利用传统共聚焦显微镜进行亚细胞分析，在405 nm处激发，并收集450-550 nm范围内的可见发射。EBen染色10 min后可见HEK293T细胞边界的荧光图案，提示EBen一开始就对细胞膜进行了染色。相对较弱的荧光表明EBen缓慢地嵌入活细胞。EBen与细胞共孵育24小时后，EBen被细胞内化。因此，使用市售的细胞染色剂进行共定位实验，以揭示EBen在细胞内的积累。CEllMask Deep Red FM和SYTO 59 Red分别用于跟踪细胞膜和细胞核。它们与EBen没有明显的荧光重叠，表明内化EBen主要分布在细胞质中。进一步使用线粒体靶向染料MitoTracker Deep Red FM和溶酶体靶向染料LysoTracker Deep Red进行共定位实验，发现EBen更倾向于在溶酶体而不是线粒体中积累。
CE与脂质的亲和力研究
CE分子完全跨越膜，它的共轭主链与脂质双分子层的疏水核心结合，而多个带电荷的侧链与膜两端的极性头基团结合。我们推测CE具有更强的亲和力，因此与脂质双分子层的相容性更好。我们首先利用基于POPC:POPG摩尔比为85:15的luv进行了生物物理实验，研究了膜形态的变化。在65°C下加热1小时以方便插膜后，使用DLS测量经DiR处理的luv的尺寸分布曲线发生了变化，其中PDI值相对于对照组(0.074±0.006)修改为0.415±0.014。相比之下，EBen处理后的体积分布曲线和PDI值与EBen处理后的LUVs没有明显变化，EBen处理后的LUVs在室温下保存7天，持续保持良好的稳定性。为了更好地说明DiR和EBen处理之间的差异，进一步离心。对于对照组或eben处理的luv，溶液保持清澈，无明显变化。然而，经dir处理的luv在离心后可以看到大量沉淀，光学显微镜下的尺寸约为几十微米。当脂质成分切换为纯POPC时，dir处理的luv变得更加不稳定，在65℃加热1小时后很快就会塌陷和沉淀出来。相比之下，EBentreated的luv没有明显变化，表明CE对不同成分的囊泡的使用范围更广。同时，由于其共轭长度最长，DiR在Di族中具有最窄的带隙，但其发射峰(798 nm)仍然局限于NIR - 1区域，Stokes位移值较小，为42 nm。膜掺入后，代表性的CE、EBen和EPV在1 Wcm 2激光连续照射1小时后，相对于DiR表现出更好的光稳定性。由于新的分子设计策略，CE突出了它们作为更先进的膜靶向探针的潜力。
CE的细胞靶向研究
我们利用“被动”方法(一种经典的脂质体标记技术在脂质体形成过程中将CE整合到脂膜中。简单地说，一开始将CE与脂质在有机溶剂中混合，然后经过干燥、水合和挤出工艺，制备荧光脂质体。随后，使用DLS测量的尺寸分布曲线没有明显变化，并且通过被动或主动方法制备的脂质体使用冷冻透射电镜表征光滑的囊泡膜，表明两种制备方法都不会改变脂质体的形态。与主动方法相比，被动方法制备的含CE luv具有更高的CE标记效率，其吸收光谱蓝移更多，全宽半最大值(FWHM)从259 nm减少到195 nm。在重复超滤过程中未观察到染料泄漏，表明EBen与脂质之间存在牢固的结合。相比之下，使用活性方法制备的luv，在65℃加热1小时后，用相同浓度的EBen处理，通过超滤实验检测到27%的游离染料。与主动方法相比，被动方法的荧光增强了2.5倍，即使它们消耗相同浓度的脂质和CE。相对于菁染料IR-26(0.05%)，被动法制备的EPV、EBen和EFBT在脂质体中的PLQY值分别为0.41%、0.53%和0.44%。当直接使用时，CE的高正电荷可能导致与生物样品的非特异性结合。例如，超滤实验发现，PBS中超过99%的EBen与BSA相关。可以将CE埋入脂质体结构以减轻这种不利影响。为了验证这一假设，我们选择了相对分子质量为42.7 kDa的卵清蛋白(OVA)，用100 K MWCO蛋白浓缩管超滤后，用BCA (Bicinchoninic Acid)测定其浓度。用luv包封EBen后，无界蛋白的百分比从29.3 - 0.6显著增加到75.8 - 1.4%。当将蛋白质来源替换为胎牛血清时，也观察到类似的趋势，表明脂质体包封减少了CE分子与蛋白质之间的非特异性相互作用。利用1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[氨基(聚乙二醇)-2000](铵盐)对含eben的脂质体进行聚乙二醇化，制备EBen-Lip，目的是建立一个保护性的“隐身层”，增加稳定性和体内循环时间。CE和脂质双分子层之间的紧密结合也可以稳定脂质体结构，用蛋白质进行染料脱附实验证明了这一点。为了获得更高的亮度，EBen-Lip选择了脂质与CE的摩尔比为100:3。市售的cRGD肽(购自GL Biochem)对αvβ3整合素(一种在许多癌细胞中过度表达的受体)具有高亲和力，通过巯基-马来酰亚胺偶联反应将其偶联到聚乙二醇化的EBen-Lip上。DLS检测到z平均尺寸从123.2±0.4 nm增加到125.5±0.5 nm，曼惠特尼检验的P值小于0.001，表明活性靶向荧光脂质体EBen-Lip-cRGD成功构建。首先在体外共聚焦显微镜下，通过收集EBen的可见发射光谱来评估EBen- lip - crgd的肿瘤靶向特异性。当EBen-Lip- crgd作用于乳腺癌4T1细胞时，显微镜下的荧光强度明显高于相同条件下EBen-Lip处理的荧光强度。通过将细胞切换到3T3，重复显微镜实验，3T3是一种从αvβ3整合素受体较少的小鼠胚胎中分离出来的细胞系，其中相同的EBen-Lip-cRGD处理导致荧光信号可以忽略不计。饱和游离cRGD预处理的竞争实验进一步验证了EBen-Lip-cRGD的肿瘤靶向性。
CE的体内成像研究
EBen在肝脏、甲状腺、四肢、胸骨和膀胱以及离体成像观察到的脾脏和肾脏均有积聚。EBen的广泛生物分布可能是由于其高正电荷引起的非特异性结合。注射EBen-Lip后1分钟采集的血液样品被装入脂质体后，其荧光表现出较晚时间点最强的荧光。与EBen相比，EBen- lip表现出不同的生物分布模式，主要积聚在肝脏和脾脏中，类似于许多其他纳米颗粒材料。值得注意的是，尽管EBen- lip含有相同的EBen浓度，但EBen- lip在肝脏(主要代谢器官)中的荧光降低速度更快，表明其清除性能更好。EBen-Lip最初较强的NIR-II发射和较好的相容性促使其直接用作荧光探针，例如用于血管的体内成像。与EBen相比，EBen- lip对小鼠的大脑或后肢进行近距离聚焦时，获得了高分辨率的血管网络图像。EBen-Lip横剖面上的尖峰表明含有CE的脂质体提供了更好的对比度。有趣的是，EBen被发现在骨髓中积累，这一点可以通过去除肌肉的腿骨离体成像来证明。尽管目前尚不清楚EBen是如何通过血-骨髓屏障运输的，但这种偶然现象可能会激发基于CE的新的骨髓靶向药物的发现。此外，EBen和EBen- lip之间明显不同的积累行为支持了含EBen脂质体在体内相对稳定的观点。通过4T1荷瘤小鼠的原位成像验证了CE在体内追踪脂质体载体的能力。在PBS中单剂量200 μL EBen- lip后，在皮下肿瘤处观察到微弱的荧光，可能是由于纳米脂质体增强了渗透性和滞留性(EPR)作用。然而，当用活性靶向组功能化时，eben - lip - crgd处理的小鼠在肿瘤部位显示出显著增强的NIR-II发射模式。24小时观察期后，处死小鼠进行离体肿瘤成像。eben - lipcrgd处理组的荧光强度是EBen-Lip组的2.7倍。由于EBen-Lip-cRGD和EBen-Lip最初具有相似的荧光强度，这些结果表明，cRGD组促进了脂质体载体在肿瘤部位的积累。这突出了NIR-II CE在追踪基于脂质的药物递送载体方面的潜力。
结论
在本研究中，我们设计并合成了三种新的NIR-II CE，分别命名为EPV, EBen和EFBT，它们由不同的“翼”结构组成，以分析不同寻常的双发射现象。目前的研究结果表明，额外的可见发射可能是由于CE的“翼”和“核”之间的耦合不良造成的。双发射现象还可能涉及高激发态的辐射松弛和其他过程，需要进一步深入研究。从实际的角度来看，除了利用其NIR-II发射通道进行体内光学成像外，还利用常规荧光显微镜进行体外亚细胞分析。这些CE是一种潜在的新型膜靶向探针。与具有代表性的碳菁染料DiR相比，由于其独特的仿生拓扑结构，CE与脂质双分子层的相容性更好。其他优点，如红移吸收和发射光谱，更大的斯托克斯位移，更好的光稳定性，更高的水溶性和稳定性，强调了CE的应用潜力。为了在复杂的生物环境中实现特定的成像和功能，荧光团分子通常被制成纳米颗粒，例如使用亲水性聚合物封装，与蛋白质结合，或组装成金属有机框架。模拟膜的CE与天然存在的生物结构脂质体结合，减少非特异性蛋白质结合，提高生物相容性。同时，CE和脂质双层之间的精细匹配拓扑结构提供了一种多聚策略，可以在脂质体内捆绑更多的荧光团，从而增强亮度。与之前的CE分子BBT不同，新CE引入了扭曲主链，通过操纵分子内位阻来减轻膜融合后的ACQ效应。与BBT相比，我们观察到随着染料浓度的增加，新CE的荧光逐渐增强。采用被动法制备的方法制备的荧光脂质体掺入效率高、分布均匀、荧光更亮。通过与cRGD肽的生物偶联，制备了活性靶向荧光脂质体EBen-Lip-cRGD。利用1100 nm长通滤光片收集NIR-II辐射，进一步对体内荷瘤小鼠进行成像，突出了新CE的脂质体跟踪性能。利用EBen-Lip清晰描绘血管网络的图像也表明，含CE脂质体本身具有成为新型荧光显像剂的潜力。这些结果表明，CE分子平台作为脂质双分子层的仿生学，在疾病诊断和治疗方面具有很高的应用潜力。
参考文献
NIR-II Conjugated Electrolytes as Biomimetics of Lipid Bilayers for In Vivo Liposome Tracking ，Yingying Meng , Ji Gao , Peirong Zhou, Xudong Qin, Miao Tian, Xiaohui Wang, Cheng Zhou,* Kai Li,* Fei Huang,* and Yong Cao, Angew. Chem. Int. Ed, https://doi.org/10.1002/anie.202318632
