内容提要
发色团的空间电子通信在理论上和实践上都很有吸引力。尽管在多色低聚物和J-聚集物中分别观察到分子内或分子间激子偶联，但它们都出现在同一分子中是不寻常的。在此，作者开发了具有分子内激子分裂的乙烯桥接偶氮二聚体。通过将二聚体包裹在F-127聚合物中，制备出J-型聚集纳米粒子，其分子间激子耦合明显，在936和1003 nm处的吸收峰和发射峰分别发生显著红移。制备的纳米制剂具有较高的光热转换能力(η= 60.3%)和超光稳定性，可在915 nm激光照射下完成肿瘤消融。这种通过调制分子内和分子间激子偶联的光疗纳米平台是开发用于肿瘤治疗的光热药物的有价值的范例。
结果与讨论
合成与表征。乙烯桥接aza-BODIPY二聚体BDP3的合成在方案1中概述。此外，还合成了aza-BODIPY二聚体BDP4和两个aza-BODIPY单体BDP1和BDP2进行比较。由相应的酮类和醛类通过经典O’shea方法得到关键的氮二吡咯甲基3a和3b。单溴化氮杂吡咯甲基3aBr和3bBr与反-1,2双(三丁基锡基)乙烯的关键双Stille偶联分别以83%和85%的产率得到氮杂吡咯甲基二聚体4a和4b，然后进一步与BF3 . et2o络合得到目标氮杂吡咯二聚体BDP3和BDP4。BDP2是通过3bBr与苯乙烯的Heck耦合，然后硼络合反应合成的。通过1H NMR、13C NMR和高分辨率质谱(HRMS)对这些染料的结构进行了表征。
分子激子偶联研究。总结了BDP1-3在各种溶剂中的光谱数据。有趣的是，偶氮abodipy二聚体BDP3和BDP4在二氯甲烷中的最大吸收峰分别在758 nm和774 nm处，与单体BDP1相比红移约100 nm。此外，BDP3还表现出显著的红移发射最大值，从原来的690 nm增加到974 nm，达到284 nm。这些光物理数据证明，将两个aza-BODIPY发色团与位于β的乙烯双键桥接可以有效地扩大π共轭，这是构建近红外染料的有效策略。BDP3的HOMO和LUMO主要在包括桥接乙烯基团在内的整个分子上离域，这也证实了π共轭的增大。相比之下，苯乙烯取代基BDP2对吸收和发射带的影响较小。当溶剂极性从己烷增加到CH3OH时，BDP1和BDP2都没有表现出明显的溶剂化效应，而BDP3的发射带随着溶剂极性的增加有轻微的红移。
与之前报道的β，β-直接连接aza-BODIPY二聚体不同，非常引人注目的现象是BDP3的主要吸收被分裂成两个主要的带(758和582 nm)，与BDP1的吸收最大值相比，582 nm的峰有74 nm蓝移。此外，在保持单体相似消光系数的情况下，吸收带出现了扩宽。这些结果表明BDP3、存在强烈的激子分裂，也称为达维多夫分裂。通过构象分析[12d]发现了二氯甲烷中BDP3的两种低能构象:相邻的aza-BODIPY单元表现出扭曲(BDP3- i)或平行(BDP3- ii)几何形状。这两种构象都允许BDP3的两个发色团之间发生强偶极-偶极相互作用。过渡偶极矩由单体的4.44 D提高到二聚体的7.79 D计算得到的异构体BDP3-I和BDP3-II的吸收带也显示出激子分裂特征，与实验数据吻合良好。
这一结果可能表明实验谱是BDP3-I和BDP3-II的构象叠加。此外，计算得到的BDP3-I和BDP3-II的吸收带分裂为3890和4805 cm-1，与实验数据也一致(3990 cm-1)。BDP3的发射带也变宽了，但仍保持在974 nm处的单峰，并出现了216 nm的Stokes位移。虽然BDP3在溶液中存在两种不同的构象，但两种构象之间的能量差相当小(0.35 kJ mol-1)，这使得构象灵活性高，构象分布宽。这也可能是其广泛的吸收，发射波段和大的斯托克斯位移在溶液中的部分原因。
作为对照化合物，BDP2也受到取代苯乙烯基的影响，与单体BDP1相比，其吸收带明显变宽，略有分裂。此外，与二聚体BDP3类似，甲氧基取代的二聚体BDP4在不同溶剂中也表现出明显的吸收带分裂，这表明乙烯桥接aza-BODIPY二聚体中以激子分裂为主。此外，在二氯甲烷中，单体的荧光寿命为1.76 ns，而BDP3的荧光寿命急剧下降至0.006 ns，这部分归因于激子分裂引起的系统间交叉增强。这种增强的系统间交叉也导致活性氧(ROS)的产生，这已被ROS捕集剂证实。在915 nm激光照射下，ROS氧化1,3-二苯基异苯呋喃(DPBF)的吸光度下降[20a]， 2 '，7 ' -二氯二氢荧光素二乙酸(DCFH-DA)的荧光增强。此外，还观察到2,2,6,6-四甲基-4哌啶酮(TEMP)中1O2的特征电子顺磁共振(EPR)信号。此外，循环伏安法还揭示了发色团之间的强相互作用。显然，氧化还原波有明显的分离，这也反映了吸收光谱中强烈的激子耦合。最后，虽然乙烯桥接的两个相同的发色团在空间上彼此相邻，但BDP3没有对称轴。因此，激子耦合可以在其圆二色性(CD)光谱中产生双胞曲线，称为激子对偶。因此，BDP3在CD谱上表现为弱信号，这是激子耦合的特征。
分子间激子偶联研究。与分子内激子偶联不同，分子间激子偶联受到分子浓度的严重影响。BDP3在二氯甲烷溶液中吸收带的分裂在2 ~ 50μM范围内没有变化。同样，当在THF/水的混合物中以5-25μM的浓度制备BDP3聚料时，与纯THF溶剂相比，BDP3的吸收带变化也可以忽略不计。相反，当浓度增加到50μM时，在880 nm处出现了一条新的吸收带，这表明BDP3的J型聚集体已经形成。作者致力于观察BDP3 j型骨料的生长过程，并在95%水溶液中以10μM制备了BDP3骨料。等待11天后，通过分光光度计监测BDP3单体向J-型聚集体的逐渐转变。
遗憾的是，在880 nm处形成的J-型团聚体的主峰钝而不明显。因此，作者将注意力转向两亲性三嵌段共聚物Pluronic®F-127，该共聚物具有环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷的a - b - a结构。由一个疏水中心核(环氧丙烷)组成的F-127胶束可以将疏水的BDP3包裹在核心中，这将有利于相邻发色团之间的紧密分子堆叠，促进BDP3稳定的j型聚集体的形成采用F-127胶束自组装方法制备BDP3纳米颗粒(NPs)，制备不同浓度的BDP3 NPs (5-50 μM)。在浓度为5μM时，BDP3 NPs在920 nm处出现了典型的J-带肩峰。
新形成的BDP3 NPs的吸收和发射集中在936 nm和1003 nm，与二氯甲烷中的BDP3相比，分别红移178 nm和29 nm。BDP3 NPs的Stokes位移为67 nm，远小于二氯甲烷(216 nm)，这也是J聚集体的特征现象。
尽管如此，BDP3 NPs的Stokes位移仍然大于先前报道的几个定义良好的J聚集物，通常只有几纳米。此外，通过动态模拟得到了BDP3 J-型聚集体中的分子堆积规律。BDP3周围有6个分子，在模拟多态性中，这些分子都与BDP3的两个发色团中的一个呈滑移排列。计算的滑移角和估计的分子中心距离如表所示。
更重要的是，利用这些滑移角和分子中心距离，根据公式S5计算BDP3 J-型聚集体的激子分裂能。估计谱移Δν ~ agg-mon＜-2390 cm-1，这一结果证实了BDP3 NPs的红移是由于分子的滑动堆叠排列导致的，这种排列允许强偶极-偶极相互作用，降低了能隙。随后，逐步向BDP3 NPs水溶液中加入THF，验证了这种自组装是可逆的。J-型聚集体完全解离，直到溶液中含有31%的四氢呋喃(体积分数)。
此外，通过透射电镜(TEM)观察到BDP3 NPs的球形形态，其平均直径约为241 nm。这种合适的直径可以通过增强渗透和保留(EPR)效应有效地积累在肿瘤细胞中此外，BDP3 NPs在水中表现出优异的稳定性，在保存30天后，其吸收变化可以忽略，这有利于后续的生物学研究。
水中光热研究。由于BDP3 NPs在水中表现出极低的荧光量子产率(0.001)和荧光寿命(0.003 ns)，因此推测其吸收的光能是通过非辐射衰变过程释放的因此，对BDP3 NPs进行了光热研究。可以预见的是，在低功率密度(0.57 W cm-2) 915 nm激光。相比之下，在相同条件下，纯水的温升可以忽略不计。随后，BDP3 NPs的光热转换能力估计为60.3%。另一方面，商业光热剂IR-1061也被制备成NPs作为对照。在相同条件下，IR-1061 NPs的升温温度远低于BDP3 NPs(50.9°C<72°C)，其光热转换能力计算为46.0%。接下来，对BDP3 NPs进行了浓度/激光功率密度依赖性实验。结果表明，加热温度与光热剂浓度和激光功率密度的增加呈正相关。
此外，光热稳定性是光热剂的一个非常重要的参数，它直接关系到光热性能。经过10次激光开关后，BDP3 NPs的加热温度仍然保持在72℃左右，而IR-1061 NPs的加热温度在每一次循环后都有所下降。结果表明，BDP3 NPs光热性能优于IR-1061 NPs，具有较高的光热转换效率和良好的光稳定性，是应用于PTT的近红外光热剂的理想人选。
体外光热研究。BDP3 NPs在水中光热研究的成功鼓励作者进一步研究其在4T1和HeLa细胞中的PTT能力。首先，通过CCK-8试验评估BDP3 NPs的暗细胞毒性。将T1或HeLa细胞与不同浓度的BDP3 NPs孵育36 h，结果表明，在浓度为70μM时，4T1和HeLa细胞的存活率均超过95%，显示了其良好的生物相容性。用不同浓度的BDP3 NPs孵育细胞后，在低功率密度激光照射下(915 nm, 0.54 Wcm-2)照射10分钟。随着BDP3 NPs浓度的增加，细胞活力明显下降，而黑暗中的细胞没有表现出毒性。计算得到的半最大抑制浓度(IC50)。对4T1细胞约为7.7μM，对HeLa细胞约为8.5μM。作者还评估了IR-1061 NPs在4T1和HeLa细胞中的PTT效应，作为BDP3 NPs的对照实验。在相同的照射功率密度和时间下，IR-1061 NPs没有表现出明显的光毒性，无论是在黑暗中还是在照射下，细胞存活率都非常接近。这可能是由于IR-1061 NPs使用的激光功率密度过低，光照时间过短，无法表现出PTT效应。值得注意的是，IR-1061 NPs具有明显的暗细胞毒性，在13μM浓度下孵育36 h后，4T1和HeLa细胞的存活率仅为40%左右。此外，还在4T1和HeLa细胞中进行了BDP3 NPs的功率密度依赖实验。当NPs浓度为10μM时，细胞活力随激光功率的增加而降低。同样的照射条件下，未添加NPs的96孔空白板作为对照组，未观察到明显的细胞毒性。
此外，活/死共染还用于显示BDP3 NPs的PTT效果。由于膜的通透性不同，AO进入活细胞后会发出绿色荧光，而PI穿过死细胞的膜会发出红色荧光。然后将细胞分为四组，分别进行不同条件的处理:不加任何处理、激光照射下单独处理、BDP3 NPs单独孵育、BDP3 NPs和激光照射下同时孵育。结果显示，只有当BDP3 NPs和激光照射共同作用时，细胞才会出现大面积死亡，并发出亮红色荧光，这验证了光毒性实验。这些实验证明了BDP3 NPs在细胞中具有先进的PTT能力，表明其在PTT中具有重要的应用潜力。
体内光热研究。由于BDP3 NPs在体外具有良好的抗肿瘤作用，随后在活小鼠身上研究了其治疗效果。将这些荷瘤小鼠随机分为四组:只注射PBS的小鼠、只注射BDP3 NPs的小鼠、同时注射PBS和激光照射的小鼠以及同时注射BDP3 NPs和激光照射的小鼠。荷瘤小鼠注射BDP3 NPs，然后暴露于激光照射(915 nm, 1 W cm-2) 10分钟。肿瘤部位的平均温度从33℃大大提高到56.3℃，而PBS和激光照射小鼠的平均温度仅为33.6℃。治疗14天后，注射BDP3 NPs和激光照射的小鼠仅观察到肿瘤体积和重量明显减小。相比之下，其他各组小鼠的肿瘤体积显著增加了3-4倍。这一数据证明BDP3 NPs对小鼠肿瘤增殖具有显著的抑制作用。此外，在14天的肿瘤治疗期间，四组小鼠体重均有轻微上升趋势，说明BDP3 NPs具有较低的生物毒性和良好的生物相容性。为了进一步研究BDP3 NPs的PTT效应和生物安全性，在治疗14 d后，对小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤等主要器官进行苏木素和伊红(H&E)染色。可以明显看到激光照射组BDP3 NPs中肿瘤出现大量白色裂纹，说明肿瘤细胞因高温坏死，而PBS组h&e染色切片变化可以忽略不计。此外，主要器官未见严重的组织损伤或炎症损伤，说明这些NPs在PTT过程中未引起明显的全身毒性。上述结果表明，BDP3 NPs成功抑制了肿瘤增殖，表现出良好的PTT效果，在PTT中具有良好的应用前景。
结论
综上所述，本工作开发了一种具有分子内激子偶联和分子间激子偶联的乙烯桥接aza-BODIPY二聚体。有趣的是，由于分子内激子耦合，其主要吸收带发生了明显的红移分裂，并将二聚体包裹在胶束纳米胶囊中，导致NPs由于分子间激子耦合而呈现J型聚集。NPs的吸收峰和发射峰分别位于936和1003 nm，与单体相比(BDP1在二氯甲烷中吸收/发射峰在658/690 nm)有明显的红移。更重要的是，这些NPs具有超热稳定性，具有较高的光热转换能力(在水中η = 60.3%)、有效的光毒性(在4T1细胞中IC50 = 7.7 μM)以及在915 nm超低功率密度激光照射下体内完全消融肿瘤的能力，表明这些NPs具有良好的光热效应，具有很大的应用潜力。
参考文献
Unique Double Intramolecular and Intermolecular Exciton Coupling in Ethene-Bridged aza-BODIPY Dimers for High-Efficiency Near-Infrared Photothermal Conversion and Therapy. Xing Guo, Jinming Yang, Mao Li, Fan Zhang, Weibin Bu, Heng Li, Qinghua Wu,*Dengke Yin,* Lijuan Jiao,* and Erhong Hao*. Angew. Chem.Int. Ed. 2022, 61, e202211081.https://doi.org/10.1002/anie.202211081.
