内容提要
将超长的激发波长、高的消光系数和突出的光热转换能力集成到一个单一的光热剂中是一个吸引人的同时也是一个极具挑战性的任务。为此，基于施主-受体(DA)型半导体聚合物，通过微妙地调节两个具有不同电子亲和力和π共轭程度的电子受体部分的摩尔比例，并充分利用分子内运动诱导的光热效应，为这一尝试开发了一种精确的双受体工程策略。优化的聚合物SP4同时表现出良好的二次近红外(NIR-II)吸收、极高的消光系数和令人满意的光热转化行为。因此，SP4纳米粒子在1064 nm激光激发光声成像(PAI)引导的光热治疗(PTT)中表现出前所未有的性能，能够准确地诊断肿瘤并完全消除肿瘤。
结果与讨论
以苯并[1，2-b：4，5-b‘]二硫杂环(BDT)骨架为给电子体(Scheme 1)，具有较强的给电子能力、突出的π共轭和共面特性。对于这两个受体，选择BBTD作为A1单元是为了吸收更长的波长，特别是近红外-II吸收，因为它具有极强的电子吸收能力。此外，为了保证足够的光捕获能力，作者小组最初开发的另一个电子受体NDi-DTYA2被引入作为A2单元，因为它非常刚性和大的共面π-骨架。BBTD和NDI-DTYA2在不同的电子吸收能力和π共轭程度方面的不同特征使得通过精确地调节它们的摩尔比和分子内电荷转移相互作用来优化近红外-II窗口的消光系数成为可能。值得注意的是，由于CN叁键的强烈伸缩振动，NdI-DTYA2的两个极度缺电子的氰基(CN)基团也可以在生成的SPS主链中作为有效的振子，这是另一种高频分子运动。由于CN叁键的存在对外界环境的限制具有很强的抵抗力，即使在聚合态下，它的存在也无疑可以促进光热转化。另一方面，周围的长链烷基链也可以促进热的产生，这些长链烷基不仅可以促进SPS的溶解，而且主要作为屏蔽单元来抑制分子间相互作用，导致相对松散的分子间堆积，从而为NPs内部的分子内剧烈运动提供充足的空间。显然，上述双受体工程策略，再加上烷基侧链工程和聚集体中伸缩振动促进的分子内剧烈运动，将使所设计的SPS具有优化的长吸收波长、良好的光捕获能力和显著的光热转换效率。
在上述分子设计的基础上，通过精确地改变NDI-DTYA2、BBTD和BDT单体的摩尔比，通过Pd催化的Stille偶联聚合，轻松地合成了一系列SPS，即SP1SP5。用核磁共振、傅里叶变换红外光谱、凝胶渗透色谱、元素分析等手段对SP1-SP5的化学结构和纯度进行了表征。SP1-SP5通过引入多个增溶长链烷基，在普通有机溶剂中表现出良好的溶解性。随着BBTD单元摩尔比的增加，SP1-SP5的低能吸收带表现出明显的从NIR-I窗口向NIR-II窗口的红移，同时由于供体和受体之间ICT的增强，吸收范围逐渐变宽。SP1-SP5的最大吸收波长分别为844、844、854、1083和1277 nm，在1064 nm处的质量消光系数分别为0.09、6.4、9.7、13.8和6.4 Lg-1 cm-1。值得注意的是，尽管SP5表现出最长的吸收波长，但由于缺乏主要与π共轭的NDI-DTYA2部分，其吸收系数显著降低，并且单体BDT、NDI-DTYA2和BBTD的摩尔比为1：0.3：0.7的SP4具有最高的ɛ(13.8lg-1 cm-1)和在近红外II区令人满意的吸光度。这些结果有力地证明了双受主工程策略在微调SPS的最大吸收波长和捕光能力方面的可行性和有效性。
从本质上讲，优良的PTA应该具有良好的光热转化能力，特别是在聚集体状态下，因为疏水性PTA通常以NPs的形式应用。为了在接下来的生物应用中提供高效的水分散和生物相容的纳米颗粒，用两亲性共聚物 DSPE-mPEG2000包裹了SP4。生成的SP4纳米粒子在水中的吸收光谱与SP4在四氢呋喃溶液中的吸收光谱相似。通过动态光散射(DLS)测定了SP4纳米粒子的平均水动力直径，其包封率为78.4%，显示出约68 nm的多分散性指数(PDI)为0.12。透射电子显微镜(TEM)测量表明，所提供的SP4纳米颗粒呈球形，颗粒尺寸约为55 nm。此外，SP4NPs的Zeta电位被测为-25.2 mV。一般情况下，负电荷诱导的静电斥力对纳米粒子有一定的稳定作用。具体地说，SP4纳米粒在胎牛血清(FBS)中储存7天后，可以忽略不计的大小和吸收变化。此外，在水和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的稳定时间分别可达7周。此外，SP4纳米粒子在不同pH值(pH 4、pH 5、pH 7、pH 9、pH 10)的水分散体中的相对吸收强度也只表现出轻微的变化。当SP4纳米粒子在1064 nm激光下连续照射30分钟时，也发现了类似的现象。这些结果表明SP4纳米粒子具有良好的化学稳定性和光稳定性。
根据SP4纳米粒子的基本性质，作者系统地评价了SP4纳米粒子的光热转化能力。在1064 nm激光照射下，观察到SP4纳米颗粒的温升明显依赖于浓度和激光功率密度。发热量与SP4纳米粒子浓度或激光功率密度呈正相关，这使得发热量易于控制。注意到，在激光照射(1 wcm-2)5分钟后，当SP4 NPs浓度为100 μL时，悬浮温度达到75.0°C的高平台，即使浓度低至50 μgml-1，也观察到温度增量(ΔT)超过40°C。考虑到PTT的阈值温度(43.0°C)和小鼠的平均体温(麻醉期间的≈30°C)，这样的温度增量(ΔT≈40°C)大大超过了所需的温升(ΔT≈13°C)，足以完全杀死活着的小鼠体内的癌细胞。根据先前报道的方法，进一步计算出SP4NPs的η为46.5%，高于SP1-3和SP5NPs，η分别为2.3%、46.4%、44.9%和42.4%。特别是，SP4纳米粒子的η是先前报道的近红外-II吸收SPs中最高的值之一，甚至远远高于一些无机PTA。毫无疑问，这些结果可靠地揭示了SP4纳米粒子由于强烈的D-A相互作用、长烷基链-有利于分子内活跃的旋转以及氰基中CN叁键不受影响的伸缩振动而具有高的光热转换输出。另一方面，SP4纳米粒子优越的光热转化性能也可以通过2‘，7’二氯二氢荧光素(DCFH)指示的不可检测的荧光信号和可忽略的活性氧物种(ROS)的产生来验证，这意味着用于荧光发射的辐射通道和用于产生ROS的跨系统通道都被禁止，并且在NPs中被激发的SP4将更有可能经历非辐射衰减路径来通过产生热来耗散激发态能量。随后，通过间歇开启和关闭激光来评估SP4纳米粒子的光热稳定性。研究发现，在十个循环的加热和自然冷却过程中，SP4纳米颗粒溶液呈现出以最大升温为指标的稳态温度变化。这种优异的光热稳定性和SP4纳米粒子良好的光热转化行为将共同确保高效和连续的热输出在光热治疗中的应用。此外，基于SP4纳米粒子的808 nm和1064 nm激光对深层组织光热能力的比较实验进一步证实了NIRII激发的PTA在即使在深层组织中也具有无可比拟的优势，这是因为NIR-II光具有更高的组织穿透能力和更少的光衰减。随着鸡胸肌厚度的增加，808 nm激光照射的样品的温度下降速度明显快于1064 nm激光照射的样品。
鉴于SP4纳米粒子具有显著的光热转化性能，本论文研究了SP4纳米粒子对小鼠乳腺癌4T1细胞的体外光热治疗能力，为其在体内的进一步应用奠定了基础。
考虑到纳米粒子的有效细胞摄取对发挥其治疗作用的重要性，本文首先对SP4纳米粒子的细胞内去向进行了研究。为了便于观察，通过纳米沉淀法将DSPE-PEG2000和DSPEPEG2000-FITC(摩尔比为9：1)与疏水性SP4共组装，以匹配激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)的原始设置，制备了异硫氰酸荧光素(FITC)标记的SP4纳米粒子。孵育3h后，在4T1细胞内观察到FITC的亮绿色荧光。此外，FITC标记的SP4 NPs被证明包裹在4T1细胞的溶酶体中，证明它们与商业LysoTracker Red的红色荧光相当共存。这些数据表明，SP4纳米颗粒可以有效地内化到细胞内，从而为SP4纳米颗粒的光热治疗奠定了坚实的基础。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测SP4纳米粒对4T1肿瘤细胞的光热抗癌活性。正如预期的那样，SP4NPs单独对细胞活力没有明显的影响，即使浓度增加到50μgmL-1也是如此。在正常的3T3、HUVEC和LO2细胞中也观察到了类似的现象。这些结果揭示了SP4纳米粒非凡的生物相容性。相反，1064 nm激光(1.0wcm-2，5min)对4T1细胞的光毒作用呈浓度依赖性，当SP4NPs浓度为50μgmL-1时，4T1细胞的杀伤率可达90%以上。即使安装了0.5 mm的鸡组织，1064 nm激光在到达细胞之前穿透，但在50μgmL-1浓度下，仍可观察到40%以上的杀伤率，高于808 nm激光照射。当SP4纳米粒浓度增加到80μgmL-1时，杀灭率可达85%以上，与无鸡组织屏障的阳性对照相当。这些结果表明，1064 nm激发的SP4纳米粒子在体外对4T1细胞具有显著的光热消融效果，即使对隐藏在深层组织中的细胞也是如此。
为了直观地显示SP4纳米粒子在1064 nm激光照射下的光热杀伤效应，用二乙酸荧光素(FDA)和碘化丙啶(PI)对不同处理的细胞进行双重染色，以区分CLSM下活的(绿色荧光的)和死亡的(红色荧光的)4T1细胞。在PBS、PBS+L和SP4纳米颗粒组中观察到强烈的绿色荧光信号，表明所使用的激光剂量的副作用可以忽略不计，并且SP4纳米颗粒具有良好的生物相容性。诱人的是，经SP4纳米粒子处理的细胞在1064 nm激光照射后发出明亮的红光，表明其对癌细胞具有良好的杀伤力。对照组(PBS、PBS+L和SP4 NPs)几乎所有的细胞都位于存活区域，而SP4 NPs加激光照射后，50.8%的细胞被诱导凋亡，4.79%的细胞被引导至坏死。显然，SP4纳米粒子与激光联合照射所诱导的明显的细胞凋亡和可检测到的坏死率明显证实了SP4纳米粒子的光诱导杀伤癌细胞的能力。
SP4纳米粒子具有良好的近红外吸收、良好的近红外区域消光系数和良好的体外光热杀伤细胞性能，通过4T1荷瘤BALB/c裸鼠评价了SP4纳米粒子在近红外II激发的PAI导向PTT中的作用。NIR-II激光激发的PAI最初被用来估计SP4 NPs在肿瘤中的积聚。将SP4纳米粒子经尾静脉注入小鼠体内后，在1200 nm的近红外激光激发下，随时间的推移记录PA图像。随着时间的延长，肿瘤区域的PA信号明显增强，36h达到最大值，48h略有下降。这种明显的时间依赖性PA信号表明，SP4NPs可以通过增强型通透性和滞留(EPR)效应有效地积聚到肿瘤部位，36h可以作为PTT体内后续肿瘤治疗的最佳时间点。
相应地进行了光热杀瘤实验。在注射后36h，用1064 nm激光(1.0WCM-2)照射肿瘤5min，用称为光热成像(PTI)的红外热像仪监测肿瘤部位的温度变化。SP4纳米颗粒治疗组的肿瘤部位温度在5分钟内从36.6℃迅速上升到62.6℃，足以导致不可逆转的肿瘤组织损伤。相比之下，在相同的激光照射条件下，对照组的温度升高可以忽略不计。尤其值得注意的是，激光照射的肿瘤部位在各个时间点的温升都明显高于正常组织，进一步证实了由于近红外激光的高度空间可控性，SP4纳米粒子的肿瘤选择性递送和照射部位的特异性光治疗效果。因此，这种智能光疗方式可以在很大程度上避免对健康器官/细胞的热损伤，显示出明显优于传统化疗的优势。在一次注射SP4纳米粒子和随后的一次性激光照射后，每隔三天进一步记录治疗小鼠的肿瘤大小和体重。令作者高兴的是，与其他三个对照组相比，SP4纳米粒+L组小鼠的实体瘤在第3天就几乎全部消除，几乎看不到肿瘤，在接下来的观察期间没有出现复发，有力地证明了SP4纳米粒强大的光热杀瘤效率。此外，小鼠体重总体上的细微差别。这四组表明SP4纳米粒的不良反应较低，这与显示SP4纳米粒高细胞相容性的体外数据很好地一致。
随后，对肿瘤切片进行组织学分析和免疫组织化学研究，探讨其体内治疗机制。苏木精-伊红(H&E)染色显示SP4NPs+L治疗组肿瘤组织广泛破坏，肿瘤细胞明显异常，可见明显的空洞，核固缩明显。相比之下，对照组可见肿瘤细胞数量过多、排列密集。SP4NPs加NIR-II照射组小鼠肿瘤组织的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)染色显示出强烈的红色荧光，显示了严重的细胞凋亡命运。此外，SP4纳米粒子和NIR-II激光照射后，可见少量Ki67阳性的增殖细胞和CD31阳性的新生微血管，这与TUNEL染色结果一致。这些数据清楚地表明，SP4纳米粒子可以作为光热治疗剂用于体内NIR-II激发的PAI引导的PTT。
考虑到PTA潜在的实际应用中的安全性问题，对SP4纳米粒子、1064 nm激光照射和SP4纳米粒子参与的PTT的生物安全性进行了仔细的检查。在给予SP4纳米粒、激光照射和SP4纳米粒加激光照射的组中，肝和肾功能标记物的生化指标与生理盐水组相比没有显著差异，表明肝和肾的毒性可以忽略不计。SP4纳米粒加NIR-II照射后，小鼠的血常规分析指标均在正常范围内，而其他三组均为严重的肿瘤进展而出现严重异常。这些数据不仅证实了SP4纳米粒作为光热治疗剂具有优越的抗肿瘤活性，而且表明在治疗过程中，SP4纳米粒几乎不会引起不良感染或炎症。此外，处理组小鼠的主要器官(心、肝、脾、肺和肾)的H&E染色数据表明，在任何处理组中都没有观察到显著的组织损伤或炎性损害。总体而言，所有令人满意的结果表明，定制良好的SP4可能成为具有良好生物安全性的高效光热治疗应用的候选材料。
结论
综上所述，本工作提出了一种新颖的双受体工程策略，以巧妙地构建高效的、具有强烈分子内运动的近红外-II吸收聚合物PTA，用于近红外-II激发的光热治疗。通过精确调节D-A结构聚合物骨架中两个具有不同特征的缺电子受体NDTA和BBTD的摩尔比，成功地获得了同时具有明显的近红外吸收和良好的捕光能力的SP4。此外，由于长的烷基链有利于分子内的活跃转动和氰基上CN叁键的伸缩振动，在掺杂的纳米颗粒中可以同时获得高达46.5%的η。SP4纳米粒子在NIR-II激光引发的体外光热杀伤4T1细胞和体内PAI引导下光热消融4T1实体瘤中的良好性能充分表明，SP4纳米粒子可以作为一种具有良好生物安全性的高效光热治疗的PTA。本研究不仅丰富了NIR-II吸收SPs的分子库，而且为进一步探索用于癌症光热治疗的多功能性PTA提供了一种“一刀切”的设计方案。
参考文献
Synchronously Manipulating Absorption and Extinction Coefficient of Semiconducting Polymers via Precise Dual-Acceptor Engineering for NIR-II Excited Photothermal Theranostics.Dr. Jiangao Li, Dr. Miaomiao Kang, Dr. Zhijun Zhang, Dr. Xue Li, Weilin Xu, Prof. Dong Wang, Prof. Xike Gao, Prof. Ben Zhong Tang. Angew. Chem. Int. Ed. 2023, e202301617. https://doi.org/10.1002/anie.202301617
