内容摘要
肿瘤内 Pt(IV) 前药的选择性激活特别有吸引力，因为它们对正常组织的损伤较小。然而，目前通过化学/光还原将 Pt(IV) 前药激活为 Pt(II) 对应物的常见方法受到对还原过程的不良时空控制和光的组织穿透深度较低的限制。在这里，通过 Stille 聚合设计了一种伪共轭聚合物，产生 PSP-Pt，其聚合物主链中含有奥沙利铂 (Oxa(IV)) 的 Pt(IV) 前药，可被 NIR-II 光激活。PSP-Pt 可以与市售脂质聚合物（即 mPEG2k-DSPE）共组装成 NPPSP-Pt。在1064 nm光照射下，NPPSP-Pt可被光激活，加速Pt(IV)还原，释放奥沙利铂，从而通过光热效应和化疗免疫疗法杀死CT26结肠癌小鼠模型中的癌细胞。这项工作报告了 NIR-II 光在癌症肿瘤治疗中加速 Pt(IV) 还原的应用。
结果与讨论
Pt(II)络合物Oxa(II)经过氧化氢处理后被氧化成Oxa(IV)络合物。为了生成具有末端溴化物官能团的化合物（Oxa-Br)，该化合物的轴向位置被官能化5-溴-2-噻吩甲酸。该化合物通过 1H、13C 和 195Pt-NMR 光谱以及高分辨率质谱进行了表征。该化合物的纯度通过高压液相色谱 (HPLC) 进行验证。通过 X 射线光电子能谱验证了金属中心的氧化态和溴基团的存在。为了研究轴向配体释放后 Oxa-Br 向 Oxa(II) 的还原过程，通过 HPLC 监测加热下 Oxa-Br 的转化。结果表明，当温度从37℃升高到55℃时，Oxa-Br向Oxa(II)的转化加速了7.4倍。
为了获得聚合物主链上含有Oxa(IV)的NIR-II光热聚合物，通过单体M1、M2、M3和Oxa-Br的Stille缩聚反应合成了基于Oxa-Br的伪半导体聚合物(PSP-Pt)。通过 1H-NMR 光谱证实了完全聚合。PSP-Pt 聚合物主链中铂络合物的负载量通过电感耦合等离子体质谱(ICP) 测定铂含量来表征。结果表明，聚合物中掺入了0.79 ± 0.35 μg mg−1(pt/PSP-Pt) 的Pt。
由于 PSP-Pt 是由 Oxa-Br 制备的，因此研究了 NIR-II 照射下聚合物可能发生的降解。虽然保持在黑暗中的聚合物保持完整，但凝胶渗透色谱 (GPC) 显示，当 PSP-Pt 暴露于 NIR-II 光时，会出现分子量较低的低聚单元的分布。这些结果表明聚合物PSP-Pt在NIR-II照射下有效地产生热量，加速金属中心的还原并导致聚合物材料的降解。这项研究描述了 Pt(IV) 络合物或材料在 NIR-II 光照射下还原的第一个例子。
研究表明，线性聚合物材料由于其高表面积和较差的细胞摄取，通常具有较差的生物性能。为了克服这一限制，将聚合物与两亲性材料共组装以形成具有改进的物理化学性质的纳米颗粒。PSP-Pt 与亲水性聚合物 mPEG2k-DSPE 混合生成纳米颗粒，即 NPPSP-Pt。使用 TEM，确认了纳米材料的球形形态。DLS 测量表明颗粒分布均匀，多分散指数为 0.2，粒径约为 115 nm。
测量 NPPSP-Pt的吸收光谱，以研究颗粒配方是否影响光物理性质。 PSP-Pt和 NPPSP-Pt的光谱具有相同的吸收带，表明颗粒配方确实影响光物理性质。NPPSP-Pt的光热性能通过监测暴露于1064 nm 照射下的溶液温度来评估。结果表明NPPSP-Pt以浓度依赖性方式加热溶液。为了研究光热稳定性，将NPPSP-Pt暴露在恒定的NIR-II 照射（1064 nm，1.0 W cm−2）下10 分钟，然后将溶液冷却 20 分钟。该循环重复五次，达到相似的最大加热温度，表明 NPPSP-Pt具有高稳定性和高效的催化加热转化能力 。通过冷却时间与驱动力温度的负自然对数之间的线性相关计算，NPPSP-Pt的光热转换效率为43.2%。值得一提的是，NPPSP-Pt的光热转换效率高于迄今为止报道的大多数光热材料（<40%）。
由于发现聚合物PSP-Pt 在辐射时裂解，通过在释放轴向配体时将八面体Oxa(IV) 还原成方形平面Oxa(II) 络合物，Pt(II) 络合物的释放进一步减少。在黑暗中或在NIR-II 照射（1064 nm，1.0 W cm−2，10 分钟）下进行研究。ICP测定结果表明，NIR-II照射显着促进了Oxa(II)的释放。完整的纳米粒子的特征是均匀分布的单峰，中心位于约 115 nm。暴露于 NIR-II 照射后，出现了以 64 和 1181 nm 为中心的两个峰。TEM 也证实了降解。
针对小鼠结肠癌 (CT26) 细胞研究了NPPSP-Pt的生物学特性。为了研究细胞摄取，用荧光团 Cy5.5 标记 NPPSP-Pt，形成荧光纳米颗粒制剂 Cy5.5@NPPSP-Pt。将颗粒与癌细胞一起孵育，并通过流式细胞术随时间监测摄取情况。随着孵育时间的延长，癌细胞内检测到的 Cy5.5@NPPSP-Pt 量不断增加。荧光信号的量化表明大约 7 小时后达到吸收最大值。随后，研究了NPPSP-Pt穿透多细胞肿瘤球体的能力。多细胞肿瘤球体是一种组织培养模型，可以模拟实体瘤的条件，例如增殖梯度、3D 细胞结构或缺氧肿瘤微环境。利用这一点，多细胞肿瘤球体经常被用来评估新型化合物的药物输送。在此，将多细胞肿瘤球体与 Cy5.5@NPPSP-Pt一起孵育，并通过共焦激光扫描显微镜监测渗透情况。图像显示每个切片深度处源自 NPPSP-Pt的发光信号，表明 3D 细胞结构的完全渗透。为了量化 Cy5.5@NPPSP-Pt的摄取量并与分子抗癌药物 Oxa(II) 进行比较，通过电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) 随时间确定细胞结构内铂的含量。随着孵育时间的延长，CT26细胞中检测到的Cy5.5@NPPSP-Pt量不断增加。Oxa(II)和 NPPSP-Pt之间的比较表明，纳米材料的吸收量大约高出一个数量级，突出了其作为药物输送系统的用途。
为了探索 NPPSP-Pt的体外抗癌作用，首先对不同肿瘤细胞系（包括 CT26 和 143B）进行NPPSP-Pt和 NPPSP-Pt + L（光照射后）的 MTT 测定。结果显示，在10μMPt下，NPPSP-Pt处理的CT26细胞的细胞存活率为52%，而Oxa(II)处理的细胞的细胞存活率为73%。NPPSP-Pt对 CT26 细胞具有比 Oxa(II) 更强的抗癌活性。值得注意的是，这种差异也存在于 143B 细胞系上。在 10 μM Pt 下，用 NPPSP-Pt处理的 143B 细胞的存活率为 54%，而用 Oxa(II) 处理的 143B 细胞的存活率为 65%。总的来说，NPPSP-Pt的抗癌活性高于Oxa(II)。
随后，进一步研究了NPPSP-Pt+L杀伤癌细胞的能力。结果显示，10μm Pt时，NPPSP-Pt+L处理的CT26和143B细胞的存活率分别仅为16%和24%。这些值远低于在相同 Pt 浓度下用 NPPSP-Pt和 Oxa(II) 处理的细胞。OV8 和 4T1 癌细胞中也出现了类似的结果。从上述结果可以看出，NPPSP-Pt+L的抗癌效果可显着提高，高于NPPSP-Pt和Oxa(II)。
先前的研究表明，Oxa(II) 可以通过化疗和免疫治疗相结合诱导 ICD 来根除癌细胞。为了研究 NPPSP-Pt是否可以触发 ICD，对 CT26 细胞进行了ICD 监测。用化合物治疗后的具体特征。使用共焦激光扫描显微镜，研究了 HMGB1 在癌细胞内的位置。在黑暗中用 Oxa(II) 或 NPPSP-Pt处理后，观察到 HMGB1 的少量迁移。相比之下，NPPSP-Pt + L 治疗触发了绝大多数 HMGB1 的分泌，诱导骨髓分化信号级联反应，从而支持抗原加工和呈递给 T 细胞。研究人员研究了癌细胞释放的 ATP，它可以吸引肿瘤特异性细胞毒性 T 细胞。研究发现，Oxa(II) 治疗不会静态影响癌细胞内的 ATP 水平。相反，在黑暗中用 NPPSP-Pt 处理，特别是 NPPSP-Pt + L 处理，有效诱导 ATP 的分泌。使用共焦激光扫描显微镜，研究了 CRT 在癌细胞内的位置。虽然在黑暗中用 Oxa(II) 或 NPPSP-Pt处理引起少量 CRT 迁移，但用 NPPSP-Pt+ L 处理诱导 CRT 从内质网易位到支持巨噬细胞相互作用的细胞表面用于肿瘤抗原呈递。综合这些结果表明 NPPSP-Pt+ L 可以高效地引起 ICD。值得注意的是，NPPSP-Pt+ L 的 ICD 效应比分子金属配合物 Oxa(II) 强一个数量级。
基于癌细胞模型中这些有希望的特性，在 CT26 荷瘤小鼠模型中进一步研究了 NPPSP-Pt + L 的治疗特性。为了了解小鼠模型内的生物分布，将 Cy5.5@NPPSP-Pt 静脉注射到动物的尾静脉中，并通过荧光成像随时间测定肿瘤中的积累。该结果表明，在整个监测期间，注射游离DSPEPEG-Cy5.5的小鼠在肿瘤中没有表现出可观察到的信号。形成鲜明对比的是，Cy5.5@NPPSP-Pt 在静脉注射后 8 小时后保留了显着的荧光强度。50小时后，处死动物，收集主要器官并通过荧光成像测定生物分布。虽然大多数 Cy5.5@NPPSP-Pt是在肝脏中发现的（纳米颗粒制剂的典型情况），但在肿瘤组织中也检测到了大量的 Cy5.5@NPPSP-Pt。值得注意的是，静脉注射的 DSPE-PEG-Cy5.5 聚合物主要积聚在肝脏中，在肿瘤中几乎没有发现任何化合物。为了研究Cy5.5@NPPSP-Pt是否能够深入穿透肿瘤，用血小板内皮细胞粘附分子1（PECAM1）对处死动物模型肿瘤组织的血管系统进行染色。虽然没有检测到来自 DSPE-PEG-Cy5.5 注射的荧光团的荧光信号，但测量到来自给予 Cy5.5@NPPSP-Pt的组织的强烈红色发光。综合这些发现表明，NPPSP-Pt 能够积聚并深入渗透 CT26 荷瘤小鼠模型的肿瘤组织。
在CT26 荷瘤小鼠模型中研究了纳米粒子在光照下产生光热效应的能力。小鼠尾静脉注射NPPSP-Pt，将肿瘤暴露于NIRII照射（1064 nm，1.0 W cm−2），并监测肿瘤部位的温度变化。虽然辐射本身导致肿瘤温度升高约 8 ℃，但 NPPSP-Pt被证明在暴露于辐射后 8 分钟内使温度升高 32 °C。这些结果非常有希望，表明 NPPSP-Pt能够在动物模型内的肿瘤部位有效产生光热效应。
在CT26 荷瘤小鼠模型中研究了NPPSP-Pt+ L 的肿瘤生长抑制作用。第0 天和第3 天，对动物尾静脉注射PBS、Oxa(II) 或NPPSP-Pt。注射一小时后，将肿瘤部位暴露于NIR-II 照射（1064 nm，1.0 W cm −2，10 分钟）。在8 天的时间内监测肿瘤体积和动物体重的变化。虽然在黑暗中用 Oxa(II)或 NPPSP-Pt治疗被证明可以稍微缩小肿瘤体积，但用 NPPSP-Pt+ L 治疗导致肿瘤明显缓解。4T1 荷瘤小鼠模型中也出现了相同趋势的结果。重要的是，动物行为正常，没有任何疼痛或压力迹象，也没有体重减轻或增加。8天后，处死动物并收集肿瘤。目视检查和肿瘤重量的测定验证了NPPSP-Pt+L强的肿瘤生长抑制作用。
为了更好地了解 NPPSP-Pt+ L 的治疗潜力，对治疗后动物模型的长期生存进行了研究。与 PBS 治疗相比，NPPSP-Pt+ L 对小鼠存活率有显着影响。这些发现表明，用 NPPSP-Pt+ L 治疗可以提高荷瘤小鼠的存活率。虽然在黑暗中用 Oxa(II) 或 NPPSP-Pt处理的动物仅观察到微小的变化，但在用 NPPSP-Pt+ L 处理的小鼠模型中观察到严重的细胞损伤，包括核碎裂和溶核。综合起来，这些结果证明了 NPPSP-Pt+ L 引起肿瘤强烈缓解的能力。
基于NPPSP-Pt+ L 的良好治疗效果和照射后触发ICD 的能力，研究了动物模型内治疗后的免疫原性反应。对携带CT26 肿瘤的小鼠尾静脉注射PBS、Oxa(II) 或NPPSP-Pt。注射一小时后，将肿瘤部位暴露于NIR-II 光照射（1064 nm，1.0 W cm−2，10 分钟）。7天后，收集肿瘤和淋巴结并通过流式细胞术进行分析。虽然在黑暗中用 Oxa(II) 或 NPPSP-Pt治疗显示肿瘤中成熟树突状细胞的水平略有升高（流式细胞术图，图的量化）以及淋巴结（流式细胞术图，图的量化），用 NPPSP-Pt+ L 处理表明成熟树突细胞的数量显着增加。成熟的树突状细胞可以通过激活T淋巴细胞来刺激机体的适应性免疫反应。利用这一点，研究了肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞的相对比例。结果显示，在黑暗中用 Oxa(II) 或 NPPSP-Pt处理后有轻微增强，但用 NPPSP-Pt+ L 处理后有强烈增强（流式细胞术图，图的量化）。综合这些发现表明 NPPSP-Pt+ L 可以有效激活免疫系统。
结论
这项研究描述了将 Pt(IV) 前药掺入可生物降解的伪共轭聚合物中，用于光热疗法和化学免疫疗法的联合治疗。基于聚合物材料的赝共轭性质，发现聚合物在 NIR-II 区域激发。重要的是，由于缺乏生物成分的吸收以及这些波长的深层组织穿透性，NIR-II 光与深部或非常大的肿瘤的治疗相关。除了聚合物在长波长激发下产生热量的能力外，Pt(IV) 络合物在释放其轴向配体后还可以还原为 Pt(II)。这项研究描述了 Pt(IV) 前药的第一个例子，它可以被 NIR-II 光还原，从而被 NIR-II 光激活，从而实现选择性药物输送和药物有效负载的释放。将这种疏水性聚合物与亲水性聚合物混合后，会生成可以在水溶液中自组装成纳米颗粒的聚合物混合物。研究发现纳米粒子在生理条件下是稳定的，但在暴露于 NIR-II 光时会迅速降解。在小鼠结肠癌细胞和荷瘤小鼠模型中评估了纳米材料的生物学特性。结果表明，纳米颗粒通过光热疗法和化学免疫疗法的联合机制具有高治疗活性。作者相信这里报道的纳米颗粒以及结构衍生物在治疗癌症肿瘤方面具有巨大的潜力。通过联合机制进行治疗干预的能力可能有助于克服耐药肿瘤。
参考文献
NIR-II Light Accelerated Prodrug Reduction of Pt(IV)-Incorporating Pseudo Semiconducting Polymers for Robust Degradation and Maximized Photothermal/Chemo-Immunotherapy. Tang, D., Zhou, H., Cui, M., Liang, G., Zhang, H. and Xiao, H. Adv. Mater. 2300048.DOI: 10.1002/adma.202300048
