内容提要
设计了一系列双光子活性环金属化铱（III）配合物（Ir1、Ir2和Ir3）。Ir1在近红外区域具有40 GM的双光子作用截面，已被开发用于靶向细胞内组氨酸。双光子显微照片显示，Ir1可以快速、选择性地照亮固定细胞和活细胞中的细胞核，并且能够在受激发射损耗（STED）显微镜下使用超分辨率（SR）技术超详细显示核组氨酸分布。
Ir1-Ir3的合成方法见方案S1(ESI)。晶体结构信息表明，Ir（III）中心InIr2采用扭曲的八面体几何形状。其中一个吡啶环与其R1（III）中心不协调，表明额外的游离吡啶部分易于定位亚细胞器。11a，16两个平面之间的连接与IR2的键长1.439Å（C00B–C00H）和1.452Å（C00S–C019）共轭，表明C–C的键长位于正常C=C双键（1.32Å）和C–C单键（1.53Å）之间。值得注意的是，羧基中存在活性氢原子旋前体离解和更高程度的电子离域，这导致非线性反应，17并且可能对活细胞中的氨基酸敏感。用于双光子过程的三重态Ir（III）配合物需要有效的系统间交叉（ISC）、较大的斯托克斯位移和相对较长的三重态激发态寿命。475 nm处的带被分配给πp*（C–N）-π*（L）配体到配体电荷转移（LLCT）过渡，可能与一些3mlct贡献混合。发射的温度依赖性位移是典型的MLCT磷光，产生于与极性MLCT发射状态稳定相关的分子周围的不同环境。为了支持实验测定的光物理性质，TDDFT计算表明，最低位三重态（T1）主要由HOMO-LUMO激发描述，具有3MLCT/3LLCT性质。第二最低状态（T2）也具有MLCT/3LLCT性质，出现于0.3 eV的能量高于T1，由于以配体为中心的激发，呈现出一些3LC特征。这些转变与实验结果一致，实验结果归因于两类转变。
Ir1在DMSO/水(DMSO：水=1：9)中的2PA作用截面(dmax)如图所示。Ir络合物的最大2PA作用截面位于780 +- 20 nm左右，Dmax值介于20和40 GM之间。2PEF的强度清楚地显示出序列Ir1>Ir3>Ir2>L。与上述讨论一致，作者发现共轭链的长度可以合理地增加适度的延伸桥，这更有利于电子跃迁浮动，这与2PA横截面的增加不一致。
为了评估其在体内体外中的应用，选择Ir1是因为它具有最大的2PA横截面。当Ir1在405 nm激发时，它在约593 nm处显示出弱发射带。通过一次和两次光荧光实验，研究了IR1与多种细胞内物质（包括氨基酸、蛋白质、DNA和RNA）的相互作用。只有组氨酸和BSA（一种富含组氨酸的蛋白质）触发了显著的发光增强。添加浓度增加的组氨酸，在493 nm处出现新的发射，强度增加对应于100 nm的蓝移。当组氨酸浓度从0增加到280mM（F=4.81%，t=97.88 ns）时，R1493 nm（F<1%，t=37.55 ns）处的磷光强度增加了27倍。磷光量子产率的显著增强表明IR1适合在水介质中使用。这些结果表明，Ir1在体外对组氨酸/含组氨酸的蛋白质具有很高的选择性。为了探索2PFM应用的潜在Ir1，研究了组氨酸诱导的Ir1的2PEF明显增强，对应于单光子激发荧光（1PEF）。此外，还进一步计算了双光子吸收作用截面（Fs），以评估Ir1和Ir-His的双光子活性。Ir1在780nm处的Fs从40GM增加到48GM(Ir1-His)。这一结果表明，Ir1在与His反应前后的双光子活性发生了明显的变化，这说明Ir1适合于使用2PFM技术跟踪组氨酸。
为了验证上述传感机制，在d6二甲基亚砜：D2O=9:1（v/v）中进行了1H NMR滴定实验。在将2当量的组氨酸添加到其Ir1溶液中后，羟基质子Ha和Hb发生了显著的峰分裂，表明在组氨酸的羧基和咪唑基之间存在二次键相互作用。利用HRMS发现了与产物[Ir1-His]对应的m/z1009.2513处的显著峰。显示了计算的前线分子位和Ir1和Ir-His的计算数据.对于Ir1-His，对应于三重态-三重态的三重态激发跃迁（498.5 nm）主要起源于HOMO-LUMO+1跃迁。LUMO+1的分布与Ir1的LUMO相似，主要定位于全吡啶配体上。然而，ofIr1 His的HOMO分布与残留在组氨酸咪唑部分的ofIr1明显不同。因此，[dπ（Ir）-π*三吡啶]3MLCT和3[吡咪唑-π *三吡啶]3LLCT的混合物负责Ir1-His的三重态-三重态转变，改善铱（III）络合物的发射。因此，R1-His发射强度的显著增强可能来自刚性分子结构中较少的非辐射过程和有利的ICT过程以及过渡特性的变化。使用Discovery Studio软件进行的分子建模计算进一步证实了该机制。对接结果表明，Ir1具有合适的正电荷和亲脂性，通过不同方向的二次键相互作用容易触发组氨酸，可以在高dock分数和低CDOCKER能量下稳定。
为了进一步探索其2PM应用，Ir1的MTT结果表明该复合物的毒性相对较低。在250 s的持续照射过程中，几乎没有观察到明显的发光变化，表明了Ir1的光稳定性。这表明R1的高光稳定性有利于长期实时跟踪。作者使用HepG2细胞作为Ir1孵育的细胞模型；使用商用核染色核红进行的共定位实验。强烈表明，Ir1以活细胞中的细胞核为靶点，从而产生高信噪比。用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）验证了作者的推测；铱的大部分定位并累积在细胞的细胞核碎片中，这表明细胞核中存在“开启”效应。在其他类型的癌细胞（HeLa和A549）的应用中也显示出类似的核摄取。因此，作者得出结论，IR1可以选择性地染色各种癌细胞的细胞核区域。此外，IR1的特异性细胞核染色仅适用于活细胞，而不适用于固定细胞。当HepG2细胞被固定并进一步与IR1孵育时，在2PM下观察到广泛的弥漫性全细胞染色模式。值得注意的是，正常细胞，HELF细胞（人胚肝成纤维细胞），在整个细胞溶质区域显示出扩散性FIR1，并被排除在细胞核之外，这可能表明Ir1的核摄取模式是癌症特异性的，但其实际机制仍在研究中。
为了进一步证实活细胞核中R1的结合物质确实是组氨酸，使用可与组氨酸物种反应的组氨酸脱羧酶（HDC）与HepG2细胞预孵育。组氨酸+Ir1处理后，HepG2细胞表现出发光开关效应，强烈表明Ir1具有高特异性的靶向胞内核组氨酸。透射电镜实验进一步证实了这一结论，因为它具有高电子密度和细胞内蛋白的原位积累。与仅用四氧化锇染色的对照细胞（四氧化锇是一种广泛用于电子显微镜的磷脂对比剂）相比，在处理过的细胞中，亚细胞膜结构清晰可见，包括线粒体、细胞内小泡、质膜和核膜。结果发现，当NIR1用作固体造影剂时，由于R1与核组氨酸结合，细胞核显示出更好的对比度。这些发现再次与2PM成像一致，都强烈表明IR1位于具有组氨酸特异性的活细胞细胞核内。
如图所示，也研究了Ir1的细胞进入途径。结果表明，在41℃时未观察到发光，表明Ir1可能通过温度依赖性途径进入细胞。Ir1作为一种简便、无创的2PA探针在活细胞中被成功利用，具有极好的光稳定性和细胞通透性，此外，它还显示出良好的组织深部渗透性，可在使用HepG2细胞和球形多细胞的实体肿瘤模型上进行，并显示出核标记。从椭球体表面到Ir1的66mm深度观察到显著的荧光强度，表明双光子激发光的深度穿透.使用Ir1成功标记核组氨酸显示出稳定的磷光、高特异性、大的斯托克斯位移和长的荧光寿命，因此作者因此，进一步推动其成像利用，在活细胞的受激发射损耗（STED）显微镜下超详细显示核组氨酸。在TPM条件下进行的初始研究（使用580–620 NM耗尽束）证明是不成功的。这些观测表明光激发进入暗状态。为了解决这个问题，使用700纳米的光束对探测器宽发射的低能边缘进行耗尽。在第二组条件下，成功获得了STED图像，并且使用了低至10mM的Ir10浓度。与普通共焦显微镜的结果相比，STED显微照片清楚地显示了分辨率更高的细胞核，具有更好的信噪比。上述结果表明，酰基氯金属铱（III）络合物如Asir1可作为双光子显微镜和STED显微镜下显示细胞内组氨酸的模型成像探针。
结论
综上所述，作者设计并合成了一系列的氮杂环丙烷（III）配合物（Ir1–Ir3），并详细研究了它们的光物理性质。Ir1在NIR区域与组氨酸反应前后，在其双光子作用截面上发生了明显的变化，从40到48 GM不等。体外结合试验，双光子共聚焦显微镜和透射电子显微镜表明Ir1可以通过二次键相互作用与组氨酸/含组氨酸的蛋白质反应，在活癌细胞的核区域形成发光产物。在STED显微镜下，使用Ir1作为活细胞成像工具的进一步贡献成功地显示了细胞核的超分辨率，并将为开发用于活细胞相关研究的双光子环金属化铱（III）配合物提供机会。
参考文献
A benzoic acid terpyridine-based cyclometalated iridium(III) complex as a two-photon fluorescence probe for imaging nuclear histidine. Qiong Zhang, a Xin Lu, a Hui Wang, ab Xiaohe Tian, *c Aidong Wang, d Hongping Zhou,Jieying Wu a and Yupeng Tian *ae. Chem. Commun., 2018, 54, 3771--3774. DOI: 10.1039/c8cc00908b
